Biochemistry of Tau aggregation and interactions in Alzheimer's disease

Tese de mestrado em Bioquímica Médica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018A doença de Alzheimer é a doença neurodegenerativa mais comum no mundo e tem características patológicas específicas tais como avanço progressivo e incessante, afetando áreas cerebrais como o hipocampo e o córtex cerebral. Esta doença degenerativa afeta as células neuronais do cérebro resultando na perda de memória, raciocínio, alterações na linguagem e mudança de comportamento nos doentes. A doença de Alzheimer é também caracterizada por neuroinflamação, amiloidogénese e distúrbios da homeostase de iões metálicos, entre outros processos celulares afetados nesta doença neurodegenerativa, a agregação do péptido β-amilóide (Aβ) em placas amilóide e a acumulação da proteína Tau anormalmente fosforilada em emaranhados neurofibrilares constituem agentes característicos causativos da doença. Apesar de pesquisa intensa, o mecanismo subjacente à agregação patológica da proteína Tau continua pouco claro e não existem terapias capazes de alterar ou mitigar a progressão da doença. O envelhecimento é o fator de risco mais proeminente para a doença de Alzheimer. Curiosamente, componentes neuronais importantes tais como os níveis de citocinas pro-inflamatórias e iões metálicos de transição como zinco, cobre e ferro encontram-se desregulados com a progressão da idade. Uma das biomoléculas alteradas nesta doença é a citocina pro-inflamatória S100B que tem os níveis proteicos elevados e é conhecida por promover a expressão aberrante da proteína precursora da β-amilóide, modular a agregação do Aβ e promover a híper-fosforilação da proteína Tau, o que exacerba as suas características amiloidogénicas. Contudo, não está reportado nenhum mecanismo claro que interliga as proteínas S100B e Tau. Este trabalho teve como objetivo investigar a interação entre a Tau e a S100B e determinar se daí decorre algum efeito regulatório da S100B sobre o processo de agregação da proteína Tau. Dado que ambas proteínas ligam cálcio e zinco, investigou-se também o envolvimento destes iões metálicos no processo de fibrilação da proteína Tau. Para o efeito procederam-se a estudos detalhados de bioquímica estrutural de proteínas e ensaios cinéticos de agregação proteica, complementados com estudos de imagem de fibras. Neste estudo utilizamos um conjunto vasto de técnicas bioquímicas e métodos biofísicos, que incluíram expressão e purificação de proteínas recombinantes recorrendo a processos cromatográficos, análise espectroscópica por dicroísmo circular no UV longínquo (UV-CD), espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier com refletância total atenuada (FTIR-ATR), espectroscopia de fluorescência e microscopia de força atómica (AFM). Na primeira fase do estudo foi necessário otimizar os protocolos de purificação proteica, nomeadamente da proteína Tau humana intacta com 441 resíduos (hTau441). O processo envolveu a realização de culturas celulares de E. coli transformadas com plasmídeo para expressar hTau441. Subsequentemente ao crescimento bacteriano e expressão proteica, seguiu-se a lise celular. O lisado obtido foi incubado a 75°C para precipitação diferencial das proteínas contaminantes do hospedeiro, uma vez que a hTau441 é termoestável mantendo-se solúvel. Uma vez que o nosso objetivo era purificar a forma monomérica da hTau441com um elevado grau de pureza, procedeu-se à realização de uma série de cromatografias (troca catiónica e exclusão molecular) em várias condições distintas, tendo-se identificado a melhor condição experimental (7.6M de ureia e 50mM de ditiotreitol) para cromatografia de exclusão molecular (SEC), da qual resulta o melhor rendimento e obtenção de proteína Tau humana monomérica com elevado grau de pureza (>95%). Para avaliar a interação entre as proteínas hTau441 e S100B verificou-se se a sua co-incubação resultaria na formação de um complexo estável. Para isso utilizou-se a técnica de SEC que permite distinguir as proteínas pela sua massa molecular. O resultado obtido evidenciou a formação de um complexo entre as duas proteínas, sendo, contudo inconclusivo relativamente à estequiometria do complexo formado. Este resultado levou-nos a investigar esta possível interação, avaliando agora as principais alterações conformacionais da estrutura secundária de ambas as proteínas, tirando partido da sensibilidade de espectroscopia de CD, uma das técnicas espectroscópicas de excelência para determinar interações proteína-proteína. De facto, a titulação da proteína S100B (rica em hélices-α) com hTau441 (desordenada) evidenciou uma série de alterações conformacionais (perda de hélices-α) indicativas de uma interação. Verificamos que a ligação de cálcio à proteína S100B favorece a sua associação com a proteína Tau. Também foi avaliada a alteração de estrutura secundária na presença de Zn2+, o que revelou uma ainda maior perda da estrutura de hélices-α, mas também um aumento da contribuição de folhas-β, que pode ser explicado pela alteração conformacional subjacente ao começo de agregação amilóide da hTau441, com formação de oligómeros ricos em folhas-β cruzadas, característicos de amilóides. Conclui-se assim que as duas proteínas interagem fisicamente e que dessa interação resultam alterações conformacionais em ambas. Não foi contudo, possível determinar a constante de ligação do complexo Tau:S100B. De seguida, e para determinar se a proteína S100B influencia a agregação da proteína Tau, realizaram-se estudos de cinética de agregação da hTau441 induzida por heparina, um modelo de estudo bem estabelecido e caracterizado para estudo do processo de fibrilação da proteína Tau. A formação de agregados foi seguida pela fluorescência de tioflavina-T (ThT), um fluoróforo repórter da formação de agregados amilóides com estruturas β-cruzadas, no qual a ThT se intercala tornando-se fluorescente. Usando esta abordagem, foi possível observar que a agregação de hTau441 pode ser modulada por NaCl, Ca2+ e Zn2+ e também pela presença da proteína S100B. Num estudo inicial foram testadas várias condições por forma a identificar aquela que seria a melhor condição para a agregação de hTau441 (0.5mg/mL de heparina e 50mM de NaCl). Após esta definição, estas concentrações foram usadas em todas as experiências de agregação. No estudo sobre o efeito de Ca2+ e Zn2+ (testados a 1.1mM) concluiu-se que ambos promovem a agregação de hTau441, reduzindo o tempo da fase de latência do processo de agregação. O efeito do Zn2+ (1.1 mM) na agregação de hTau441 (0.5-50 μM) foi muito superior do que o efeito do Ca2+, quase eliminando a fase de latência. Posteriormente analisou-se o efeito da S100B sobre a agregação da hTau441 em condições apo (S100B sem metais ligados), na presença de Ca2+ (Ca-S100B) e na presença de Zn2+ (Zn-S100B). Na presença de apo-S100B, a agregação de hTau441 foi atrasada (aumento do tempo da fase de latência de ⁓5h para ⁓20h) sendo que, contudo, a velocidade de agregação aumentou ligeiramente. No entanto, a presença de Ca-S100B resulta na completa inibição da agregação de hTau441, a partir de concentrações proteicas equimolares. Mesmo em condições subestequiométricas ([Tau] >> [S100B]), verifica-se um atraso no tempo da fase de latência. Curiosamente, utilizando o mesmo procedimento experimental, mas com Zn-S100B, não houve qualquer efeito sobre a cinética de agregação de hTau441, quando comparada com os controlos contendo apenas hTau441 e Zn2+. Conclui-se, portanto, que a proteína S100B modula a agregação de hTau441 e que este efeito é passível de regulação por associação de cálcio, mas não zinco, à proteína S100B. Com o intuito de caracterizar e identificar as estruturas amilóides formadas durante o processo de agregação da proteína Tau nas condições acima descritas, recorreu-se à técnica de microscopia de força atómica para analisar a topografia dos agregados formados. Este estudo permitiu determinar que em condições apo, na presença de Ca2+ e na presença de Zn2+, houve formação de fibras amilóides. Apenas na condição na presença de Ca-S100B não ocorreu a formação de fibras hTau441, tendo-se, contudo, constatado a formação de agregados não amilóides, provavelmente devido à interação entre S100B na presença de Ca2+. No seu conjunto, os resultados deste trabalho contribuíram para um melhor entendimento de processos bioquímicos passíveis de regularem a agregação da proteína Tau, com impacto na compreensão de processos fisiopatológicos subjacentes à Doença de Alzheimer. De facto, sabe-se que nesta patologia a proteína S100B está substancialmente aumentada, assim como a proteína Tau monomérica. Especificamente, este estudo contribuiu para desvendar o mecanismo de agregação da hTau441 na presença de Zn2+ e Ca2+, bem como a contribuição da S100B na cinética de agregação da hTau441 e a consequente formação de fibras. Espera-se que este estudo permita abrir novos caminhos para a investigação futura das funções das interações proteína-proteína na doença de Alzheimer, processo de neuroinflamação e influência de iões metálicos.Alzheimer’s disease (AD) is characterized by neuroinflammation, amyloidogenesis and disturbance of metal homeostasis. In this neurodegenerative disorder, the accumulation of highly phosphorylated Tau protein in neurofibrillar tangles constitutes one causative agent of the disease. Regardless of intense research, the mechanisms underlying pathological aggregation of Tau remain unclear and no disease-modifying therapies are available. Interestingly, important neuronal components such as pro-inflammatory cytokines and transition metal ions levels are consistently deregulated with aging, which is the most prominent risk factor for AD. In particular, the S100B pro-inflammatory cytokine is upregulated in AD and is known to promote β-amyloid (Aβ) precursor protein overexpression, modulate Aβ aggregation and promote Tau hyperphosphorylation. It was also discovered intercellular co-localization of S100B and Tau neurofibrillary plaques in AD patients brain tissue; however no clear mechanistic relationship between S100B and Tau has been established. The goal of this work was to investigate the interaction between Tau and S100B and to determine if this interaction influences Tau aggregation. Since metal ions are deregulated in AD and both proteins have metal binding properties, we have investigated how calcium and zinc influence protein structure, interactions and Tau aggregation. The work employs several advanced biochemical and biophysical methodologies, including recombinant protein expression and purification using protein chromatography, circular dichroism (CD), attenuated total reflectance Fourier transform infrared (ATR-FTIR), thioflavin-T (ThT) fluorescence spectroscopy and atomic force microscopy (AFM) imaging. The results obtained suggest that recombinant full-length human Tau (hTau441) and S100B interact and form a stable complex, as assessed by a size exclusion chromatography (SEC) assay. We demonstrate that this interaction involved protein secondary structure changes leading to loss or relaxation of α-helical structure of S100B, and that the interaction is strongly favored by Ca2+ binding to S100B, as evaluated by CD and ATR-FTIR. In the presence of Zn2+-bound S100B, a greater loss of α-helical structure is observed, concomitantly to an increase of β-sheets, which could be explained by the onset of hTau441 amyloidogenic aggregation. Furthermore, we determined that hTau441 heparin-induced aggregation, followed by ThT fluorescence, can be modulated by NaCl, Ca2+ and Zn2+ and also by the S100B protein. We set the concentration of NaCl at 50mM since it is the best pro-aggregation concentration. Interestingly, both Ca2+ and Zn2+ enhanced the aggregation propensity of hTau441. Ca2+ reduces up to 4-fold the lag phase compared to the apo hTau441 aggregation and Zn2+ that markedly accelerates the lag phase, greatly reducing the time of lag phase. In the presence of apo S100B, hTau441 aggregation was delayed (from ⁓5h to ⁓20h), albeit the aggregation velocity was slightly increased. In the presence of Ca-S100B, hTau441 aggregation was completely inhibited at protein equimolar concentrations and above. Even at substoichiometric levels, Ca-S100B was able to substantially delay the time of lag phase up to 8 times. However, Zn-S100B does not have an effect on hTau441 aggregation kinetics. AFM topographic imaging of aggregates at end-time points of hTau441 aggregation showed amyloid fibril formation in all conditions, except in the condition with S100B and Ca2+, in which non-amyloid aggregates were mostly observed. Altogether, the results from this work contributed to unravel the mechanism of hTau441 aggregation in the presence of Zn2+ and Ca2+, as well as to elucidate the contribution of S100B in the aggregation of hTau441 and fibril formation. We expect that these findings will open new avenues for further investigations of the roles of protein-protein interactions, neuroinflammation and neurometals in AD physiopathology