The therapeutic potential of small molecules p53-MDM protein-protein interaction inhibitors

Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2016Ao longo dos anos, vários estudos científicos têm comprovado a importância da proteína supressora de tumor p53 na homeostase celular. Esta proteína encontra-se inativada em aproximadamente 50% dos tumores humanos, quer seja por mutação ou por deleção do seu gene. Por outro lado, a inativação da p53 por inibição reversível é frequentemente observada nos tumores que expressam a forma selvagem da proteína. Esta inativação pode resultar da sobre-expressão dos seus reguladores negativos, tais como a proteínas MDM2 e MDMX, conduzindo a patologias oncogénicas caracterizadas principalmente pela expressão da p53 do tipo selvagem. Vários estudos têm demonstrado que a interação da p53 com as MDM’s envolve três aminoácidos hidrofóbicos (Phe19, Trp23 e Leu26) da proteína p53. Além disso, sabe-se que a reativação da p53 é facilitada pela inibição destas interações. Nos últimos anos, várias famílias de compostos têm sido concebidas e desenvolvidas como moduladoras da atividade da p53. No entanto, o objetivo de desenvolver uma terapia anti-tumoural baseada na inibição das interações p53-MDM’s, e consequentemente na reativação da p53, encontra-se ainda no início, com apenas alguns candidatos em ensaios clínicos. Deste modo, torna-se premente a descoberta e desenvolvimento de inibidores mais potentes e seletivos para a interação entre a p53 e os seus reguladores negativos. Nos últimos anos, o nosso grupo de investigação tem vindo a investigar o potencial de várias famílias de spirooxindoles com anéis de cinco membros para o tratamento do cancro. Trabalhos anteriormente desenvolvidos pelo grupo, mostraram que as spiropirazolinas e spiroisoxazolina oxindoles apresentam propriedades anticancerígenas in vitro. O anel spiro encontrado nestes compostos funciona como uma estrutura heterocíclica rígida, a partir da qual podem ser projetados os três grupos lipofílicos que mimetizam a Phe19, Trp23 e Leu26 da p53. Estudos mais detalhados sobre o mecanismo de ação das spiroisoxazolina oxindoles mostraram que estes compostos inibem a interação p53-MDM2. No entanto, estes compostos apenas induziram moderada atividade anti-proliferativa (IC50 cerca de 35 μM) para a linha celular de cancro colo-retal humano HCT-116. Estudos de química computacional indicaram que esta moderada atividade resulta provavelmente da orientação espacial do oxindole nestes compostos não permitir que mimetizasse o resíduo Trp23 da p53, fundamental para ocorrer a ligação à proteína MDM2. Em particular, os estudos de docking molecular mostraram que o oxindole é projetado para a cavidade que seria ocupada pela Phe19 da proteína p53, enquanto os grupos aromáticos ligados ao anel de isoxazolina são projetados para as cavidades Trp23 e Leu26 da p53. A substituição do átomo de oxigénio do anel de isoxazolina por um grupo N-Ar, poderia permitir não só a inclusão de mais um substituinte no anel de 5 membros, como uma reorientação dos substituintes do anel de 5 membros de forma a ocuparem as cavidades da MDM2 a que se ligam os aminoácidos da p53. Por esse motivo, foi desenvolvida uma família de spiropirazolina oxindoles que foi testada nas linhas celulares de cancro da mama humano, MCF-7 e MDA-MB-231. Os compostos mais ativos apresentaram um valor de IC50 cerca de 7 μM. Adicionalmente, estes compostos apresentaram seletividade para a linha celular MDA-MB-231 e não foram tóxicos em células não tumorais Hek-293T. Nesta dissertação, otimizou-se esta família de compostos (spiropirazolina oxindoles) e avaliou-se em mais detalhe os seus efeitos biológicos. As spiropirazolina oxindoles foram obtidas através de uma reação de cicloadição 1,3-dipolar entre 2-indolinonas e nitrilo iminas (formadas in situ a partir de cloretos de hidrazonoílo). Esta nova biblioteca de compostos foi caracterizada e posteriormente avaliada quanto ao seu potencial anti-proliferativo in vitro, utilizando as linhas celulares humanas de cancro colo¬retal HCT-116 e cancro da mama MCF-7 e MDA-MB-231, e glioma de murino GL-261. Para a linha de cancro colo-retal os compostos apresentaram atividades entre os 11-13 µM, e para as linhas de cancro da mama MCF-7 e MDA-MB-231 apresentaram atividades de 7-12 µM e 6-11 µM, respetivamente. No caso da linha celular de glioma de murino, apenas um composto apresentou valores de atividade anti-proliferativa na mesma gama de valores com um IC50 de 19 µM. De salientar, a inclusão de um grupo N-Ar aumentou para mais do dobro a capacidade anti-proliferativa em HCT-116 p53, quando é feita uma comparação direta entre os compostos equivalentes de spiroisoxazolina oxindoles. Com o intuito de avaliar o potencial citotóxico dos compostos em células saudáveis, foi realizado o ensaio de viabilidade celular em fibroblastos de colon humano normal e em culturas primárias de astroglia de murino. Como resultado, dois compostos (2e e 2m) pertencentes à família spiropirazolina oxindoles não apresentaram citotoxicidade nas células saudáveis, apesar de serem citotóxicos nas linhas celulares de cancro. O mesmo não se verificou para o composto 2q, para o qual foi observada citotoxicidade tanto em células normais como cancerígenas. Os compostos não citotóxicos em células normais foram então avaliados quanto à sua capacidade de indução de apoptose e paragem do ciclo celular na linha celular HCT-116. Os resultados demonstraram que estes compostos induzem tanto a morte por apoptose como a paragem do ciclo celular na fase G0/G1, estando ambos os fenómenos dependentes do tempo de exposição ou concentração de composto utilizada. Com a finalidade de confirmar a capacidade desta família de compostos para induzir a morte celular, foram ainda avaliados os níveis de libertação da enzima citoplasmática lactato desidrogenase (LDH) indicativos do grau de rutura da membrana celular e, por conseguinte, de morte. Os resultados obtidos corroboraram o ensaio de apoptose, confirmando assim a capacidade de indução de morte dependente da concentração. As spiropirazolina oxindoles apresentaram ainda a capacidade de aumentar os níveis de expressão da p53 e induzir a inibição da MDM2, através da diminuição dos seus níveis de expressão proteica. Adicionalmente, a aptidão destes compostos para inibir a interação p53-MDM2 foi observada através do ensaio de complementação de fluorescência bimolecular (BiFC), e foi ainda verificada uma boa estabilidade em PBS (pH 7.4). Por último, foi observado um efeito sinergético entre um agente quimioterapêutico amplamente utilizado na clínica e um dos compostos em estudos. As spiropirazolina oxindoles foram também avaliadas quanto à capacidade de induzir apoptose e paragem do ciclo celular na linha de glioma de murino GL-261. No entanto, os resultados obtidos não demonstraram qualquer evidência de indução de apoptose ou paragem do ciclo celular nestas células, indicando que estes compostos não têm potencial terapêutico neste tipo de tumores. No âmbito desta tese foi também estudado em mais detalhe o mecanismo de ação de três spirotriazolina oxindoles previamente desenvolvidas no grupo como potenciais agentes anticancerígenos. Resultados obtidos anteriormente, tinham demonstrado que esta família apresentava boa seletividade para as linhas de cancro da mama MCF-7 e MDA-MB-231, sem apresentar citotoxicidade na linha não-tumoral Hek-293T. Observou-se ainda a capacidade destes compostos para inibir a interação p53-MDM2, ativar as caspases-3 e -7 e, consequentemente, induzir apoptose. Por último, uma boa estabilidade em plasma já tinha sido observada para os compostos em estudo. De forma a estudar o eventual mecanismo de ação desta família de compostos como potenciais agentes anticancerígenos, na presente dissertação, testaram-se os compostos mais promissores de spirotriazolina oxindoles em células da linha de cancro colo-retal HCT-116, tendo-se verificado que estes compostos induzem apoptose e clivagem da PARP, assim como a paragem do ciclo celular na fase G0/G1, sendo esta dependente do tempo de exposição ou da concentração de composto utilizada. Adicionalmente, avaliou-se a capacidade destes compostos para ativar a p53 e diminuir os níveis de expressão de MDM2, indicando uma potencial inibição da interação p53-MDM2. A indução de apoptose e paragem do ciclo celular foi também avaliada na linha celular de cancro da mama MDA-MB-231. Contudo, os resultados obtidos não demonstraram qualquer indução de apoptose após 72 horas de exposição das células ao composto. Porém, às 48 horas de exposição das células ao composto foi possível verificar a ativação das caspases-3 e -7 e paragem do ciclo celular na fase G2/M. Por último, os compostos mais promissores de spirotriazolina oxindoles foram testados em fibroblastos de colon humano normal, não se tendo verificado citotoxicidade para as concentrações testadas. Em suma, nesta dissertação demonstrou-se o potencial de cinco compostos (2e, 2m, 7f, 7h e 7z) pertencentes a duas famílias de spirooxindoles, contendo anéis heterocíclicos de 5 membros, como agentes anticancerígenos e inibidores da interação proteína-proteína p53-MDM2.Over the years, several scientific studies have been proving the importance of the p53 tumour suppressor protein, in cellular homeostasis. This protein is found inactivated in approximately 50% of human cancers, by mutation or deletion of its gene. Moreover, the inactivation of p53 by reversible inhibition is frequently observed in various human cancers, especially in those expressing wild type p53. This inactivation results from overexpression of its negative regulators such as MDM2 and MDMX, leading to oncogenic pathologies, mostly characterized by expression of a p53 wild type form. Several studies have shown that p53 interaction with its negative regulators involves three main hydrophobic amino acids (Phe19, Trp23 and Leu26) in the p53 protein. Moreover, it is known that p53 reactivation is facilitated by inhibition of its negative regulators. In recent few years, several families of compounds were designed and developed as modulators of p53. However, the development of a p53 reactivating cancer therapy through inhibition of p53–MDM´s interaction is still at the beginning, with only a few candidates entering clinical trials. Therefore, the discovery of more powerful and selective p53–MDM´s interaction inhibitors are still an unmet need. The work developed in this master thesis aimed at developing new anticancer agents containing a spirooxindole scaffold having a pyrazoline ring. The spiro ring works as the rigid heterocyclic scaffold, from which the three lipophilic groups can be projected to mimic the p53 amino acids. The first goal included the development and optimization of a potential new anticancer agent by 1,3-dipolar cycloaddition reaction, complemented with biological activity studies, such as evaluation of cell death and cell cycle progression, and analysis of p53¬MDM2 interaction. In addition, studies of combination therapy using the newly synthetized molecules and a chemotherapeutic agent commonly used in the clinic, were also performed and finally, the stability of the compound in a saline solution was assessed. The second main goal of this thesis was to understand the effect of changing the carbon atom by a nitrogen atom in position 4´ of the pyrazoline ring. The results presented here reveal the potential anticancer activity of the new molecules, as shown by the ability to induce apoptosis and cell cycle arrest, inhibit the interaction between p53 and MDM2, while presenting good stability in PBS and no cytotoxic effects in normal human cells. Furthermore, a synergistic effect with the chemotherapeutic agent was observed. The change of the carbon atom for a nitrogen atom in position 4´ (pyrazoline ring replaced by a tryazoline ring) led to a new family of small molecules that has the ability to increase the expression of p53, thus leading to apoptosis and cell cycle arrest. In addition, these compounds were not cytotoxic in human normal cells