Effect of nutritional supplements on the aquaporin-mediated oxidative stress

Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2018As aquaporinas (AQPs) são canais transmembranares que estão amplamente expressas em organismos vivos, sendo responsáveis pelo transporte de água e pequenos solutos, como o glicerol. Até à data, foram identificadas treze AQPs (0-12) em mamíferos que estão dividas em: aquaporinas ortodoxas (AQP0, AQP1, AQP2, AQP4, AQP5, AQP6 e AQP8), aquagliceroporinas (AQP3, AQP7, AQP9 e AQP10), dependendo da sua capacidade para transportar água ou água e glicerol. AQP11 e AQP12 estão inseridas no grupo de aquaporinas não-ortodoxas ou S-aquaporinas devido à sua localização subcelular e permeabilidade ainda incerta. Algumas aquaporinas têm a capacidade de transportar outros solutos como amónia (AQP8) e/ou peróxido de hidrogénio (hAQP1, hAQP3, rAQP5 e hAQP8), sendo que estas são chamadas de peroxiporinas. O peróxido de hidrogénio (H2O2), é conhecido como uma espécie reativa de oxigénio que é capaz de provocar dano em proteínas, lípidos e ácidos nucleicos sendo bastante associado ao stress oxidativo. Contudo, recentemente o peróxido de hidrogénio tem vindo a ser identificado como tendo um papel essencial em várias funções vitais e vias de sinalização associadas à divisão, migração e sobrevivência celular. Estas espécies reativas de oxigénio estão constantemente a ser produzidas nas células devido aos processos metabólicos. Contudo podem também ser gerados pela exposição celular a radiação, xenobióticos ou metais pesados. O stress oxidativo ocorre quando a quantidade destas espécies reativas de oxigénio é bastante superior à capacidade de ação das defesas antioxidantes. Existem dois sistemas de defesa antioxidante bastante importante nas células. A enzima catalase e a glutationa, que funcionam como principais agentes de remoção de espécies reativas de oxigénio mantendo os níveis redox intracelular em níveis não-prejudiciais para a homeostasia celular. Os polifenóis são caracterizados pela presença de grupos fenol na sua estrutura química. Os polifenóis são o maior grupo de fitoquímicos e existe em grande quantidade em plantas comestíveis. Uma dieta rica em polifenóis mostrou ser bastante benéfica para a saúde. Até agora, foram identificadas mais de 8000 estruturas fenólicas em vegetais, frutos, azeite e vinho. Podem ser divididos em vários subgrupos como: flavonoides, ácidos fenólicos, curcuminóides, estilbenos e taninos. Vários estudos propuseram que uma ingestão elevada de polifenóis pode ser associada à diminuição de vários tipos de doenças incluindo doenças cardiovasculares, várias formas de cancro e doenças neurodegenerativas. Recentemente foram descritos vários estudos sobre o efeito e a influência destes compostos nutricionais na expressão e atividade das AQPs. Polifenóis bioativos mostraram ter alguma influência na expressão, bem como nas propriedades biofísicas das AQPs de mamífero. Devido à capacidade das AQPs para transportar peróxido de hidrogénio e aos efeitos benéficos dos polifenóis, decidimos investigar a permeação ao peróxido de hidrogénio pela aquaporina 3 humana e a aquaporina 5 humana, bem como, o efeito de compostos alguns compostos nutricionais (curcumina, naringenina e hesperidina) e de um extrato de uma planta chamada Mahonia aquifolium que tem vindo a mostrar efeitos antioxidantes, anti proliferativos, anti-inflamatórios e anticancerígenos, no stress oxidativo mediado pelas AQPs. Para este efeito, foi usado um sistema de expressão heteróloga de levedura Saccharomyces cerevisiae cujas aquaporinas endógenas foram silenciadas (aqy1 e aqy2). A aquaporina 3 e a aquaporina 5 de Homo sapiens foram previamente clonadas num vetor de expressão pUG35 que foi utilizado para transformar a estirpe de S. cerevisiae YSH 1770. Primeiramente, fomos determinar a função das aquaporinas através da técnica de interrupção brusca de fluxo “stopped-flow”. Os ensaios foram realizados a pH 5 (pH ótimo das leveduras) e ao pH 7.4 (pH fisiológico em tecidos animais). Seguidamente fomos observar a sensibilidade das estirpes que expressam as aquaporinas através de dois ensaios: ensaio de fenótipo, onde as células foram sujeitas a um stress crónico (dois dias) com várias concentrações de H2O2, e um ensaio de formação de colónias, em que as células foram sujeitas a um stress agudo (uma hora) com uma concentração de H2O2. Posteriormente, com o objetivo de verificar se há efeito do H2O2 nos sistemas de defesa antioxidante das células, fomos verificar os níveis de atividade da catalase e o conteúdo total de GSH nas células em condições basais e após adição de H2O2. Por fim, fomos avaliar e quantificar a acumulação de ROS intracelular, bem como o efeito dos compostos acima mencionados através de um método que utiliza uma sonda específica para ROS (H2DCFDA). Para este efeito, as células controlo que apenas possuem o vetor vazio (pUG35) e as células que expressam as aquaporinas 3 e 5 foram incubadas com várias concentrações de H2O2 e a variação de fluorescência devida à acumulação de ROS intracelular foi medida ao longo de uma hora. Em seguida fomos investigar o efeito dos compostos nutricionais acima descritos no stress oxidativo mediado pelas aquaporinas. As células foram previamente incubadas com uma concentração conhecida de cada composto e tratadas com uma concentração escolhida no ensaio anterior. As variações de fluorescência foram acompanhadas ao longo de uma hora. Os nossos resultados mostraram que as ambas as aquaporinas estavam funcionais para o transporte de água (AQP5) e para o transporte de água e glicerol (AQP3). Uma vez que a AQP3 é regulada pelo pH, os resultados mostraram também que a pH 5 esta aquaporina está inativa, ou seja, não transporta água nem glicerol, e que a pH 7.4 se encontra aberta. Relativamente aos ensaios de fenótipo verificou-se uma alta sensibilidade por parte da estirpe com expressão de AQP5 ao peróxido de hidrogénio a partir da concentração mais baixa, enquanto que, curiosamente a estirpe com expressão de AQP3 não apresentou qualquer sensibilidade. Nos ensaios de formação de colónias verificamos que a estirpe com expressão de AQP5 mostrou uma sensibilidade inicial ao H2O2 seguida de uma recuperação celular após uma hora de incubação. Relativamente à estirpe que expressa AQP3, verificamos que a pH 5 as células mostraram ter uma percentagem de sobrevivência ligeiramente maior que o controlo, enquanto que a pH 6.5 verificamos uma alta sensibilidade ao peróxido de hidrogénio após quinze minutos de incubação com uma ligeira recuperação após uma hora de incubação. Após verificar os níveis de atividade da enzima catalase e quantificar os níveis de glutationa total nas células, verificamos que não existiram variações significativas nestes níveis em condições basais nem após a incubação com uma concentração conhecida de peróxido de hidrogénio para as diferentes estirpes. Os resultados relativos à medição da acumulação de ROS intracelular mostraram que a estirpe com expressão de AQP3 apresentou níveis de acumulação bastante baixos a pH 5 e elevados níveis a pH 7.4 logo a partir de concentrações baixas de H2O2. Relativamente à estirpe que expressa a AQP5, os níveis de acumulação de ROS foram bastante similares para ambos os valores de pH embora estes níveis tenham sido significativamente inferiores aos observados para a AQP3 a pH 7.4. Por último, relativamente ao efeito dos compostos nutricionais no stress oxidativo mediado pelas aquaporinas verificamos que existe um efeito de remoção e diminuição dos níveis de ROS nas células. Em todas as estirpes os compostos naringenina e curcumina apresentaram os melhores resultados com importante destaque para a curcumina que apresentou um efeito de remoção bastante elevado. O extrato da planta Mahonia aquifolium apresentou os níveis mais baixos enquanto que o composto hesperidina, apesar de apresentar alguma função na diminuição dos valores de ROS na estirpe que expressa a AQP3, mostrou um efeito controverso na estirpe que expressa a AQP5.Aquaporins (AQPs) are transmembrane channel proteins widely expressed in living organisms responsible for the transport of water and small solutes such as glycerol. Until now, thirteen AQPs (0-12) were identified in mammals are grouped into orthodox AQPs (AQP0, AQP1, AQP2, AQP4, AQP5, AQP6 and AQP8) and aquaglyceroporins (AQP3, AQP7, AQP9, AQP10), depending on their ability to permeate water or water and glycerol. AQP11 and AQP12 are grouped as unorthodox or S-aquaporins due to their distinct evolutionary pathway and permeability still uncertain. Some AQPs are also able to transport other solutes such as ammonia (AQP8) and/or hydrogen peroxide (AQP1, AQP3, AQP5 and AQP8) being named peroxiporins. The class of polyphenols is characterized by the presence of phenol units in their chemical structure. Polyphenols are the largest group of phytochemicals and they exist in eatable plants. Diets enriched in these polyphenols were found to exert many beneficial effects to human health. So far, more than 8000 phenolic structures have been identified in vegetables, fruits, olive oil and wine. They can be divided in many subfamilies such as flavonoids, phenolic acids, curcuminoids, stilbenes and tannins. Epidemiological studies propose that a high intake of polyphenols can be associated to a decrease of several types of diseases including cardiovascular diseases, specific forms of cancer, and neurodegenerative diseases. Several studies have reported the influence and effect of these nutritional compounds in AQPs expression and activity. Bioactive polyphenols have shown to have some influence in the expression as well as in biophysical properties of mammalian AQPs. Due to the ability of AQPs to permeate hydrogen peroxide and knowing the beneficial effects of polyphenols, we decided to investigate the permeation of hydrogen peroxide by human aquaporin 3 and human aquaporin 5, as well as the effect of specific nutritional compounds (curcumin, naringenin and hesperidin) and a plant extract of Mahonia aquifolium in the AQP-mediated oxidative stress. For this purpose, we used a yeast heterologous expression system of Saccharomyces cerevisiae, which is endogenous aquaporin-deleted (aqy1 and aqy2 knock-out). The Homo sapiens AQP3 and Homo sapiens AQP5 genes were previously cloned in an expression vector pUG35 and were used to transform the strain S. cerevisiae YSH 1770. Firstly, we determined the function of each aquaporin using the stopped-flow technique at pH 5 (yeast physiological pH) and at pH 7.4 (mammalian physiological pH), followed by assessment of the cells sensitivity to H2O2 using a phenotypic growth assay (chronic stress) and a colony forming unit assay (acute stress). Then, we decided to investigate the effect of H2O2 in the antioxidant defense system by measuring the catalase levels and total GSH content in cells. Afterwards, the intracellular ROS accumulation and the effect of each compound were determined using a specific probe for ROS (H2DCFDA). Our results showed a high sensitivity of hAQP5 expressing cells to H2O2 in the phenotypic growth assay but in the colony forming unit assay we observed an initial sensitivity followed by a cellular recuperation. Cells expressing hAQP3 showed higher intracellular ROS accumulation at pH 7.4 whereas cells expressing hAQP5 showed a similar accumulation at both pH 5 and pH 7.4. Curcumin and naringenin reduced ROS accumulation and showed to be the most efficient compounds against oxidative stress