Targeting necroptosis in human disease: potential novel modulators

Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2017Necroptosis is an alternative pathway of regulated cell death, occurring independently of caspases, and mediated by receptor interacting serine/threonine-protein kinase-1 (RIP1), RIP3, and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) protein. Necroptosis participates in the pathogenesis of several human conditions and activation may be beneficial for treating cancer. Despite this information, there are currently no pharmacological inhibitors or activators of necroptosis available with therapeutic properties. Colon cancer is the second most prevalent cancer worldwide and the third with the highest mortality rate. Cancer therapy has improved in recent years, but pro-apoptotic therapies still face cancer resistance. In this thesis, we started by screening three libraries of newly synthesized compounds for its ability to modulate necroptosis, using the murine fibrosarcoma L929 cell line as an in vitro model. We identified 7 compounds with the ability to inhibit TNF-α-induced necroptosis L929 cells by more than 70%. To further characterize compound activity, the half maximal effective concentration (EC50) for inhibiting necroptosis was determined. The compound with the lowest EC50 - MS-PSR90 - was further shown to reduce TNF-α-induced MLKL phosphorylation. Interestingly, one of the compounds - SAS9 - strongly induced necroptosis in both L929 cells and in human colorectal adenocarcinoma cells HT29; IC50 values were 16.96 and 49.73 μM, respectively. Interestingly, SAS9 concomitantly induced apoptosis in both cell lines, with increased caspase-3/7-like activity. In L929 cells, SAS9-induced necroptosis encompassed MLKL phosphorylation but not increased RIP1 expression. In conclusion, several novel modulators of necroptosis were identified in our screening, including a potential inducer of necroptosis. A better understanding of its mechanisms of action, as well as the investigation of pharmacokinetic properties, should help to determine their potential utility in cancer treatment.A necroptose é uma via de morte celular regulada alternativa e independente de caspases, mediada pelas proteínas cinase receptor interacting serine/threonine-protein 1 (RIP1), RIP3 e mixed lineage kinase domain-like (MLKL). A necroptose faz parte da patogénese de várias doenças e recentemente foi descoberto que a sua ativação pode ser benéfica no cancro. Apesar da necroptose ser responsável por várias patologias, não existe nenhum inibidor ou indutor farmacológico de necroptose com propriedades terapêuticas. O cancro do colon é o segundo cancro mais prevalente a nível mundial, sendo o terceiro mais mortífero. A terapia contra o cancro é cada vez mais eficaz, mas são vários os casos de resistência à terapia indutora de morte celular por parte das células cancerígenas. Neste trabalho começámos por estudar três bibliotecas de compostos sintetizados de novo, usando a linha celular murina de fibrosarcoma L929 como modelo in vitro, para procurar potenciais moduladores de necroptose. Identificámos 7 compostos com a capacidade de inibir a necroptose pelo TNF-α em células L929 em mais de 70%. Para melhor estudar estes 7 compostos e a sua atividade, determinámos a concentração que induz metade do efeito máximo (EC50) de inibição na necroptose. Desta análise selecionámos o composto com menor valor de EC50 – MS-PSR90 – para averiguar a sua capacidade de reduzir a fosforilação da proteína MLKL, um dos passos fundamentais da necroptose. MS-PSR90 foi capaz de reduzir a fosforilação da proteína MLKL induzida pela necroptose causada pelo TNF-α. De interesse surgiu outro composto, SAS9, com a capacidade de aumentar a morte celular causada pelo TNF-α em células L929. O SAS9 parece ser capaz de induzir necroptose na linhas celular murina L929 e na linha celular humana HT29 de adenocarcinoma coloretal, apenas quando privilegiámos essa via, com valores de IC50 de 16,96 e 49,73 μM, respetivamente. Verificámos, ainda, que o SAS9 também induz apoptose em ambas as linhas celulares, medida pelo aumento da atividade da caspase-3/7. Estes resultados são particularmente importantes em células resistentes a agentes pro-apoptóticos, onde o SAS9 poderá induzir necroptose. Por outro, em células não possuindo a maquinaria de necroptose, o SAS9 é indutor de apoptose. No caso da linha celular HT29, quando privilegiámos a morte por necroptose, esta parece ser independente da RIP1, visto que a Nec-1, inibidor da RIP1, não consegue reverter a necroptose. Nas células L929, a indução de necroptose pelo SAS9 aumenta a fosforilação de MLKL, comprovando a existência de necroptose, mas sem aumentar a expressão de RIP1. Em conclusão, vários novos moduladores de necroptose foram identificados no nosso estudo, incluindo um potencial indutor de necroptose. No entanto, é necessário perceber melhor os seus mecanismos de ação, como também as propriedades farmacocinéticas, para determinar o seu potencial e utilidade no tratamento do cancro.This project has received funding from European Structural and Investment Funds through the COMPETE Programme and from National Funds through FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, under the Programme grant SAICTPAC/0019/2015 and by LisbonPH fellowship