S100B targeting to reduce demyelination and EAE pathogenesis

Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2017A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória crónica e autoimune com uma forte componente neurodegenerativa, resultando em défices severos nas funções motoras e cognitivas. Apesar da evolução do conhecimento nas últimas décadas, os mecanismos subjacentes à destruição da mielina e dos respetivos axónios, bem como a interação igualmente importante entre os mecanismos degenerativos e os mecanismos de reparação ainda não estão completamente esclarecidos. A proteína S100B é uma pequena molécula de ligação ao Ca2+, sendo membro da família S100. Esta proteína é principalmente expressa por astrócitos e exerce funções quer intracelulares, atuando como molécula de sinalização, quer extracelulares, executando efeitos benéficos ou prejudiciais dependendo da sua concentração. Estudos recentes demonstraram que a expressão de S100B encontra-se aumentada em doentes com EM, e que os seus níveis elevados estão correlacionados com a reatividade da glia e o aumento da expressão do seu recetor RAGE, tendo um papel fundamental na resposta inflamatória exacerbada desta doença. Num trabalho mais recente o nosso grupo demonstrou o papel benéfico da inibição de S100B no decurso de um dano desmielinizante, usando um modelo ex vivo. Com esse trabalho, pretendemos entender se ao modular a molécula inflamatória S100B, usando desta vez um novo composto, podemos prevenir a patogénese associada à doença de EM. Decidimos utilizar a pentamidina, fármaco correntemente utilizado na clinica para outras indicações terapêuticas, e que tem a capacidade de se ligar diretamente à S100B. Para abordar esta questão, primeiro fomos verificar se a ligação da pentamidina ao S100B poderia prevenir a patogénese associada ao modelo de desmielinização ex vivo. Os nossos resultados sugerem que a pentamidina é capaz de prevenir não só a desmielinização, bem como diminuir a produção exacerbada de fatores inflamatórios, indicando um efeito benéfico na prevenção da patogénese da desmielinização e da inflamação associada. Em seguida, caracterizamos o eixo S100B-RAGE num modelo animal de EM, o Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE), numa tentativa de perceber se seria um bom modelo para testar uma terapêutica dirigida para a S100B. Os nossos resultados mostraram que os animais induzidos para EAE apresentam uma elevada expressão de S100B e RAGE, bem como citocinas pró-inflamatórias. Curiosamente, estes animais quando tratados com dimetil fumarato, um medicamento usado na prática clínica em EM, demonstraram uma reduzida expressão de ambas as proteínas S100B e RAGE em paralelo com a recuperação da patogénese desmielinizante. Assim, não só comprovámos que o modelo de EAE é um bom modelo para ensaiar o novo medicamento pentamidina, como demonstrámos que a ligação S100B-RAGE pode ser uma nova estratégia terapêutica mais específica para prevenir a desmielinização e a expressão exacerbada de fatores inflamatórios.The autoimmune disease multiple sclerosis (MS) has strong inflammatory and neurodegenerative components, characterized by severe effects on motor and cognitive functions. Despite the scientific advances in this area in recent years, the mechanisms underlying myelin and axonal destruction and the equally important interaction between degenerative and repair mechanisms is not yet completely clarified. S100B is a small Ca2+ binding protein member of the S100 family. Is mostly expressed by astrocytes and can exert functions both intracellularly, acting as signaling molecule, and extracellularly, exerting beneficial or detrimental effects in a concentration-dependent manner. Recent studies demonstrated that S100B protein expression is increased in both CSF, serum and post-mortem plaques of MS patients and that its high levels are correlated with glial reactivity and increased expression of its receptor RAGE, having a role in the excessive inflammatory response of this disease. More recent work from our group has shown beneficial outcomes of S100B inhibition in an ex vivo demyelinating model. With this work we intended to understand if by targeting the inflammatory molecule S100B with a specific drug pentamidine, already used in clinical practice for other therapeutic indications, we may prevent MS-associated pathogenesis. To address this issue, we first assayed whether the direct binding of the drug pentamidine to S100B could prevent the pathogenesis observed in the ex vivo demyelination model. Our results suggest that pentamidine is able to prevent demyelination and decrease the exacerbated production of inflammatory factors, indicating a beneficial effect in the prevention of demyelination and associated inflammatory pathogenesis. Next, we also characterized the S100B-RAGE axis an in vivo animal model of MS, the Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE), as an attempt to identify a good animal model to assay the S100B-targeting therapy. Our results showed that EAE animals highly express S100B and RAGE, as well as other pro-inflammatory cytokines. Curiously, when the animals were treated with dimethyl fumarate, a drug used in clinical practice for MS, it was detected a decreased expression of both proteins in parallel to the reduced loss of myelin fibers. Therefore, not only we demonstrated that EAE is a good model to assay the new drug pentamidine, but also showed that targeting S100B-RAGE axis may be a new and more specific therapeutic strategy to prevent demyelination and exacerbated expression of inflammatory factors