Microbial structure and nitrite reducing communities across the Atlantic Ocean

Tese de mestrado em Bioinformática e Biologia Computacional, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017O Oceano Atlântico é o segundo maior oceano do nosso planeta, e consiste em duas bacias em forma de S, separadas longitudinalmente pela Crista Médio-Atlântica. Estas formações geológicas influenciam as correntes, as temperaturas e a composição química da água, e consequentemente, as formas de vida que a habitam. A Crista Médio-Atlântica é caracterizada, ao longo de toda a sua extensão, pela presença de atividade vulcânica, que introduz na coluna de água enormes quantidades de metais e minerais a altas temperaturas. De notar a existência de zonas de alta produtividade como o Mar dos Sargaços, e a presença da corrente termo-halina, onde a água afunda na proximidade dos polos e volta a emergir nos oceanos Indico e Pacífico. A árvore da vida divide-se em três domínios: Eucariota, Bactéria e Arqueias. Arqueia e Bacteria formam o grupo denominado Procariota, o qual ocupa todos os habitats presentes no oceano e, por isso, constitui a maior porção de biomassa e faz parte central de vários sistemas biogeoquímicos. O Azoto está presente nos seres vivos em vários componentes orgânicos. Transforma-se em diferentes formas químicas no processo conhecido como “Ciclo do Azoto”. Estes processos são em grande parte mediados por procariotas e, de especial interesse para este estudo, encontra-se o processo de desnitrificação, no qual o Nitrato, numa série de passos de redução, se torna em Azoto atmosférico. Atualmente, os microbiologistas utilizam diversas ferramentas moleculares para estimar a diversidade e identificar os micróbios, com base nos quais podemos começar a fazer estudos de biogeografia microbiana, biodiversidade, etc. Apesar dos padrões já identificados para estes seres, os fatores por trás dos padrões biogeográficos continuam pouco caracterizados, estando ainda em discussão se os que predominam são o nicho ecológico clássico e competição ou se, de acordo com a teoria neutral, serão a dispersão e a deriva. A diversidade filogenética não fornece informação acerca do funcionamento do ecossistema. Os genes funcionais podem ser estudados neste sentido, como é o exemplo do gene nir, responsável pela redução de nitrito (desnitrificação) dentro do ciclo de Azoto. Foram desenvolvidos modelos para explicar os mecanismos causadores de diversos fenómenos, os quais fornecem simulações sem serem necessárias futuras observações no alvo em estudo. O presente estudo tem como objetivo caracterizar a diversidade filogenética e as comunidades procariotas envolvidas no processo de desnitrificação, ao longo do Oceano Atlântico e verificar a aplicação de um modelo preditivo da distribuição das mesmas. Procedeu-se à colheita de amostras em duas expedições (Geotraces-1 e -2) ao longo de um transepto no sentido norte-sul no lado Ocidental do Oceano Atlântico. Em 51 estações entre as latitudes 65°N e 55°S foram colhidas 4 a 8 amostras em profundidades desde a superfície até 4000 metros de profundidade. Para a colheita das amostras de água foram utilizadas garrafas Niskin , acopladas a um sensor CTD. As diferentes regiões oceanográficas amostradas foram classificadas da seguinte forma: North Atlantic Arctic Province (ARCT), North Atlantic Drift Province (NADR), North Atlantic Gyral Province (NAG), Western Tropical Atlantic (WTRA), South Atlantic Gyral (SATL) e Subantarctic Province (SANT). Para caracterizar a comunidade procariota, foram utilizadas amostras de quatro profundidades diferentes, colhidas em duas estações em cada região oceanográfica, de forma a sequenciar nirK e 16S rRNA de Bactérias e Arqueias com tecnologia Illumina. Após a extração, amplificação e sequenciação dos genes nirK e textit16S rRNA, foram utilizadas três pipelines (Uparse, Qiime e Mothur) para calcular a tabela de Unidades Taxonómicas Operacionais (Operational Taxonomic Units - OTUs) e os correspondentes índices de biodiversidade, para comparação. Os resultados destas pipelines foram semelhantes entre si, pelo que apenas os resultados vindos de Uparse foram utilizados no desenvolvimento posterior do estudo. Esta pipeline usa ferramentas e comandos de usearch, já que Uparse faz parte desta coleção de software. Para atribuir taxonomias às diferentes unidades, foi feito um blast com as sequências representativas das OTUs para comparar com a base de dados SILVA_123 (para 16S rRNA) e uma base de dados desenvolvida (para nirK) no departamento de Microbiologia Oceanográfica da Universidade de Viena. Para melhor identificar padrões de diversidade, foram calculados, para cada amostra, índices de diversidade e equitatividade de Shannon e o número de Chao. O modelo desenvolvido para prever a distribuição das OTUs, calculou para cada uma delas, a distribuição normal multidimensional das variáveis ambientais observadas nos locais em que a unidade em estudo estava presente, e ponderada pela quantidade de OTUs aí registadas. De seguida, a distância de Mahalanobis foi medida entre a média multidimensional e cada local amostrado. Esta distância foi usada como aproximação à variância, e usada para calcular a quantidade de OTUs em cada amostra, através da sua subtracção à média quantidade da OTU. Da sequenciação das nossas amostras resultaram 4 111 873 sequências. As pipelines Uparse, Qiime e Mothur obtiveram respetivamente 1 986, 7 941 e 244 734 OTUs das sequências das bactérias e o tempo de processamento foi aproximadamente 3 horas, 2 dias e 2-3 semanas respetivamente, com os índices de biodiversidade semelhantes para os produtos das três pipelines. Os filos de Arquias presentes no Oceano Atlântico incluem Euryarchaeota, Woesearchaeota (DHVEG-6), Thaumarchaeota, Aigarchaeota e o grupo marinho de fontes hidrotermais (MHVG). O mais representado foi o Taumarchaeota (51,7%), seguido do Euryarchaeota (45,2%). Em termos de abundância, o filo Euryarchaeota aumenta relativamente ao resto da comunidade de Arquias, em baixas latitudes, no ambiente epipelágico, em contraste com Thaumarchaeota e Euryarchaeota que habitam o meio batipelágico inferior. As comunidades de Arquias agruparam-se de acordo com a batimetria em que foram encontradas, e encontrando-se mais próximas de comunidades de batimetrias semelhantes. Os filos de bactérias presentes no Oceano Atlântico incluem Proteobacteria, Cyanobacteria, Actinobacteria, Chloro_exi, Bacteroidetes, Acidobacteria, Planctomycetes, Marinimicrobia (SAR406), Nitrospirae, Parcubacteria, Verrucomicrobia, LCP-89, Lentisphaerae, Hydrogenedentes, Deinococcus-Thermus, Gracilibacteria, Spirochaetes, PAUC34f, Gemmatimonadetes, Sacharibacteria, Deferribacteres e Firmicutes. O mais representado foi Proteobactéria (63,7%). O filo Chloroflexi aumentou em profundidade e em baixas latitudes. O Actinobacteria foi mais abundante à superfície, e com redução da abundância nas regiões SANT, WTRA e ARCT. À superfície, o filo Bacteroidetes apresentou maiores abundâncias no hemisfério norte, enquanto em profundidade, foi mais abundante em altas latitudes. O Cyanobacteria esteve presente nas camadas superficiais, em abundâncias relativamente altas (11,6%). Tal como as Arqueias, as comunidades bacterianas também se agruparam de acordo com a profundidade. Contudo as regiões ARCT e WTRA formaram um grupo à parte. As Arqueias apresentam duas formas de nirK: tipo a e tipo b, enquanto as Bactérias apenas possuem um. As comunidades de Arqueias que possuem tipo “a” apresentaram três agrupamentos: comunidades do ARCT-meio batipelágico superior-SANT mesopelágico, meio batipelágico inferior e o terceiro com as comunidades presentes nas camadas superficiais. As do tipo “b” apresentaram dois grupos: um com as comunidades do meio batipelágico superior e a comunidade do ARCT do meio batipelágico inferior, e a outra com as comunidades do meio batipelágico inferior. As comunidades bacterianas que possuem nirK agruparam-se principalmente segunda as regiões, com comunidades ARCT e NAG bem definidas, e um terceiro grupo com as comunidades do meio batipelágico inferior. O modelo aqui desenvolvido resultou em índices de diversidade inferiores aos observados e, no caso dos dados das Arqueias, os mesmos padrões de profundidade nos índices Chao (superfície-batipelágico inferior menor que batipelágico superior) entre os dados observados e os do modelo. Os índices de Shannon para os dados do modelo das bactérias, apresentaram um aumento com a profundidade, o mesmo padrão que é observado para os índices de Chao dos dados originais recolhidos. Neste estudo foi cartografada, pela primeira vez, a distribuição de vários filos ao longo do Oceano Atlântico, tendo sido também confirmados os padrões de distribuição em outros estudos (bipolar e tropicalismo). Ambas as comunidades de arqueias com nirK, estão estratificadas ao longo das camadas do Oceano, o que pode estar associado a maiores taxas de fornecimento de nutrientes à superfície em comparação com o meio batipelágico. Em contraste, comunidades de bactérias com nirK, diferenciaram-se de acordo com a região, provavelmente devido às formações dominantes de massas de água presentes nestas áreas, que não se misturam entre si, possibilitando segregação. O modelo mostrou-se adequado em algumas situações mas revelou debilidades noutros casos, necessitando de melhorias para permitir extrapolações de dados a nível global.The Atlantic Ocean is the second largest water mass on the globe, with a complex biogeochemical system. As such, prokaryots have available a myriad of different environments to exploit resources, namely, nitrogen compounds, in which they participate and manipulate to form the nitrogen cycle. In this study we aim to characterize the microbial phylogenetic and denitrification diversity throughout the Atlantic. For this, water samples were retrieved from four depths in 12 points across the Atlantic, to extract, sequence and analyse the 16S rRNA and nirk genes using three different pipelines. In addition, environmental data was retrieved to attempt to predict the distribution of each microbe in the studied area, by developing a Mahalanobis distance based model. From the three pipelines, the most promising results came from Uparse. The results from 16S rRNA showed that Archaea communites tended to segregate mostly on depth while Bacteria segregated in relationship to their regional distribution. While the results from nirk reveal that Archaeal nirK-a containing communities consisted of three main clusters and Archaeal nirK-b communities were composed of two clusters. Furthermore, Bacteria harboring nirK clustered mainly according to the oceanographic region. The developed model could not show similar results observed in the field, and could not be applied to the nirK dataset. Certain phila distribution were cartographed in this transect for the first time, and patterns of distribution visited in other studies could be observed (bipolar and lower latitude bound phila). Both Archaea nirK harbouring communities were depth-stratified which could be associated to the higher nutrient supply rates in the epi- and upper mesopelagic as compared to bathypelagic waters. In contrast, bacterial nirK harboring communities clustered according to the oceanographic regions probably due to water mass formations. In the future, further work must be employed in the development of distribution explaining models