Identification and study of lipid metabolism genes by qPCR in Rubisco mutants of Chlamydomonas reinhardtii

Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017Chlamydomonas reinhardtii é uma microalga modelo tendo sido usada para estudos da fotossíntese e do metabolismo energético dos lípidos. É o organismo eucariótico em que pela primeira vez foi possível modificar os genes das subunidades da enzima chave da fotossíntese, a ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase/oxigenase (Rubisco). A enzima, além de assimilar o CO2 atmosférico, também funciona como oxigenase, catalisando a primeira reação da via fotorrespiratória, o que a torna um ponto fundamental do metabolismo do carbono. A Rubisco é uma das mais abundantes enzimas na natureza, com uma massa molecular total de 560 kDa. É constituída por 16 subunidades, 8 subunidades grandes (LSU, 55 kDa) e 8 subunidades pequenas (SSU, 15 kDa). Após a formação da enzima, as 8 subunidades grandes estão dispostas em dímeros em torno de um canal central que influencia a eficiência do centro catalítico, a especificidade CO2 / O2 e a estabilidade de toda a enzima. Contudo, pouco se sabe sobre a expressão génica e metabolismo energético dos lípidos em organismos com uma alteração profunda no canal central da Rubisco. A enzima também está presente no ciclo de Calvin-Benson, onde catalisa a primeira reação da via fotorrespiratória, o que o torna um ponto fundamental do metabolismo fotossintético do carbono. A síntese de Rubisco consome uma parcela substancial de recursos nutricionais de plantas e a sua degradação afeta a redistribuição de nutrientes dentro do organismo, o que significa que a Rubisco pode ter uma função de armazenamento em condições fisiológicas específicas, como falta de enxofre (S) ou azoto (N). Um dos focos principais para o uso desta alga tem sido a sua capacidade de produzir H2 e biodiesel, que ocorre especificamente em condições de stress ambiental, como por exemplo falta de azoto. Uma das consequências deste tipo de stress em C. reinhardtii é a síntese e acumulação de triacilglicerol (TAG), que é um precursor do biodiesel. Além disso outros processos como a fotossíntese e a produção/concentração de proteínas e clorofilas também sofrem alterações. Tendo tudo isto em conta, o foco desta investigação foi a caracterização fenotípica de um mutante de C. reinhardtii, I58W3, que na cadeia polipeptídica da subunidade pequena da Rubisco poSSUi uma mutação, três triptofanos (W) substituem uma isoleucina (I) na posição do resíduo aminoácido 58. Pelos estudos de cristalografia da Rubisco de Chlamydomonas o resíduo 58 localiza-se na entrada do canal central da estrutura da holoenzima. No presente foram realizados vários testes ao longo do crescimento das culturas controlo e I58W3 que visaram caracterizar este mutante a nível fotossintético, através de leituras da concentração de O2 nas células e respetivas taxas fotossintéticas e de respiração, assim como leituras acerca da eficiência do aparelho fotossintético através de PAM; foram determinadas as concentrações de clorofilas e de proteínas ao longo do tempo das culturas em células mutantes e no respetivo controlo, bem como a monitorização do peso seco das culturas e do número de células ao longo dos cinco dias de crescimento; foi feita com detalhe uma análise da composição lipídica através de cromatografia gasosa e cromatografia por camada fina, assim como leituras por espetrofotómetro de amostras das culturas coradas com Red Nile. Os níveis de Rubisco em I58W3 foram comparados com o controlo por eletroforese de proteínas e immunoblotting. Finalmente, alguns genes de interesse foram estudados, tentando comparar a sua expressão em células da cultura controlo com células da cultura I58W3. Adicionou-se mais um fator de comparação a este estudo, a carência de azoto no meio de cultura, por ser indutor da síntese de lípidos de reserva em microalgas. Em situação de deficiência de azoto tanto o mutante I58W3 como o controlo diminuíram o teor de clorofila e de proteína. A nível fotossintético, comparando o controlo com o mutante I58W3, as taxas de fotossíntese foram menores para o mutante, o que indica alguma dificuldade na assimilação de CO2 pela Rubisco, estando em linha com a mutação destas células. A análise por PAM também indica possíveis danos no aparelho fotossintético nesta estirpe mutante, o que também contribuirá para uma menor eficiência na produtividade. O mutante I58W3 mostra uma menor capacidade de absorção de energia quando comparado com o controlo, assim como valores inferiores de eficácia no transporte de eletrões e menos centros de reação. Além disso também apresenta valores mais acentuados de dissipação de energia sob forma de calor. A análise dos níveis da Rubisco mostram ser menores no mutante I58W3 do que no controlo, o que pode indicar também que esta estirpe não só tem dificuldades em assimilar eficientemente CO2, como este fator é agravado pelo teor baixo da enzima Rubisco no cloroplasto das células de C. reinhardtii. Uma análise da composição lipídica leva-nos a crer que, como resposta das células a uma fotossíntese deficiente, ocorre uma alteração metabólica que provoca uma maior síntese e acumulação de lípidos, principalmente TAG. A análise genética, por qPCR, de genes relacionados com a síntese lipídica parece indicar que estes estão a ser expressos mais frequentemente na estirpe I58W3 do que em células controlo. Além disso, a expressão de um gene envolvido na fotossíntese também parece corroborar a hipótese de que este processo não é tão eficaz em I58W3. Uma análise genética feita a amostras controlo e I58W3 a vários genes indica que as alterações a nível de acumulação de lípidos podem estar relacionadas com a síntese de novo destes, ou com uma menor síntese de dessaturases de ácidos gordos. O mutante I58W3 apresenta maior expressão de DGAT1, uma proteína envolvida na síntese de TAG, que o controlo, sendo que esse aumento é mais acentuado em condições de deficiência de azoto. Este mutante também apresenta valores de expressão de CrDES inferiores ao controlo, o que nos indica que existe uma acumulação de ácido linoleico em detrimento de ácido pinolénico em I58W3. A proteína cytb6f encontra-se mais expressa em I58W3, embora a eficiência fotossintética deste seja menor que a do controlo. A síntese da hidrogenase HydA1 não varia significativamente em I58W3 independentemente da presença ou ausência de azoto. Os resultados obtidos permitem-nos concluir que, dos genes estudados, existem diferenças a nível da sua expressão devido à mutação em conjunto com a deficiência de azoto. Por outro lado a síntese de proteínas como a hidrogenase HydA1 ou a galactolipase PGD1 parecem não mudar com a mutação. O fato de que esta estirpe consegue acumular lípidos neutros como resposta às consequências da sua mutação, assim como à deficiência de azoto, é fulcral no âmbito da temática proposta. A produção de biodiesel seria então possível utilizando estas algas em conjunto com um meio cuja característica principal seria a falta de azoto. A união destes dois fatores poderá tornar possível no futuro culturas cujo objetivo é a produção de biodiesel.Chlamydomonas reinhardtii is a unicellular, soil-dwelling green alga that has been the focus of several studies regarding photosynthesis and biodiesel production. When grown in specific conditions, such as sulphur or nitrogen (N) deficiency, this organism increases its H2 production as well as triacylglycerol (TAG) synthesis, which occurs as a response to lower photosynthetic rates. In this investigation we characterize the phenotype of a C. reinhardtii mutant that performs a deficient CO2 assimilation. This mutant, named I58W3, has three tryptophan amino acids replacing one isoleucine amino acid in Rubisco small subunit, close to Rubisco central channel. Phenotypic characterization involved the growth of C. reinhardtii cultures under standard growth condition (N-replete) and N deprivation in TAP medium for 5 days. During the growth period cell number, dry weight, protein and chlorophyll contents and photosynthetic rates were measured. Lipid composition of C. reinhardtii cell lines was assessed through gas chromatography and thin layer chromatography, as well as Red Nile staining and subsequent spectrophotometry. Photosynthetic apparatus efficiency and integrity was also evaluated by pulse amplitude modulation (PAM) analysis. In order to compare Rubisco enzyme levels in control and I58W3 mutants, protein gel electrophoresis and immunoblotting were performed. Finally, quantitative PCR of several genes related to lipid metabolism and photosynthesis was performed in order to investigate transcriptional changes between I58W3 mutants and the control strain, under N-replete and N deprivation conditions. Both protein and chlorophyll levels were affected under nitrogen deprivation as their concentration is lower in both control and mutant cells. Mutant cells appear to have a decreased photosynthetic efficiency and their photosynthetic apparatus does not function the same way as it does in control cells. Rubisco enzyme levels decrease in I58W3 cells and the expression of several genes, such as FAD or ω-13, is also lower in I58W3 cells in response to nitrogen deprivation. Overall, I58W3 cells show a promising role in subsequent biodiesel production, since they show an increase in TAG lipid accumulation and decreased photosynthetic rates. Further genetic analyses of other genes, regarding different photosynthetic pathways, should be made in order to guarantee a thorough research and a complete database on I58W3 mutants