Clinical and molecular characterization of portuguese patients with a clinical diagnosis of MODY

Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017A diabetes mellitus, ou simplesmente diabetes, pode ser definida como um conjunto complexo de perturbações crónicas de cariz metabólico caracterizadas por hiperglicémia. A diabetes tipo MODY, do inglês Maturity-onset diabetes of the young, é uma forma monogénica de diabetes. Inicialmente descrita em 1974 por Tattersall, a diabetes tipo MODY engloba um grupo de fenótipos heterogéneos, clinica e geneticamente, caracterizados por alterações no funcionamento normal das células beta do pâncreas e por um padrão de hereditariedade autossómico dominante. De uma forma geral, a diabetes tipo MODY tem um perfil não-insulino dependente e manifesta-se em crianças e indivíduos jovens, sendo tipicamente diagnosticada antes dos 25 anos. A diabetes tipo MODY aparenta ser rara, estimando-se que seja responsável por 0,6-2% dos casos de diabetes na Europa. No entanto, é frequente esta forma de diabetes ser equivocamente diagnosticada como diabetes tipo 1 ou tipo 2, pelo que a sua prevalência real deverá ser superior. Um dos grandes trunfos no combate a este subdiagnóstico da diabetes tipo MODY são os testes genéticos. Desde a década de 1990, foram 13 os genes associados à MODY. Mutações em heterozigotia nos genes GCK e HNF1A são as causas mais frequentes de diabetes tipo MODY, correspondendo a cerca de 70% dos casos. Logo a seguir estão as mutações em heterozigotia nos genes HNF4A (hepatocyte nuclear factor 4 alpha) e HNF1B, que correspondem a cerca de 15% dos casos. O gene GCK, localizado no cromossoma 7 (7p13), codifica o enzima glicocinase (glucokinase - GCK), também conhecido como hexocinase IV. Este enzima monomérico possui três isoformas - a isoforma 1, presente nas células beta, e as 2 e 3, presentes no fígado - e, no interior das células, atua como um sensor do nível de glicose. Nos hepatócitos, este enzima intervém no desencadear da glicólise e glicogénese, enquanto facilita a exocitose de insulina nas células beta. A diabetes tipo MODY, subtipo GCK, resulta de mutações de perda de função em heterozigotia no gene GCK, diminuindo a atividade do enzima, e caracteriza-se por uma hiperglicémia moderada, assintomática e não progressiva que se manifesta desde o nascimento. Estas mutações acabam por diminuir a quantidade de glicogénio sintetizado e impedem a normal libertação de insulina, ao aumentar a concentração mínima de glicose necessária à sua secreção. O gene HNF1A, localizado no cromossoma 12 (12q24.31), codifica um fator de transcrição (hepatocyte nuclear factor 1 alpha - HNF1A) homodimérico. Este fator de transcrição possui três isoformas, A, B e C. As três estão presentes no fígado, rins, pâncreas e intestinos mas a primeira predomina no fígado, rins e pâncreas fetal, enquanto a isoforma B predomina no pâncreas adulto. O HNF1A integra uma complexa rede de fatores de transcrição, desempenhando um papel regulador na expressão de diversos genes durante o desenvolvimento embrionário. No fígado, o HNF1A regula a expressão de vários genes hepáticos, como o gene que codifica para a albumina. Nas células beta, intervém na expressão de insulina e na proliferação e morte celular. A diabetes tipo MODY, subtipo HNF1A, resulta de mutações em heterozigotia no gene HNF1A. Estas mutações podem ter diversos efeitos, reduzindo a secreção de insulina em resposta a glicose e aminoácidos, e alterando a expressão de genes envolvidos no transporte (GLUT2) e metabolismo de glicose, afetando processos como a glicólise, gluconeogénese e derivação de aminoácidos para o ciclo de Krebs. O subtipo HNF1A está associado a defeitos na proliferação das células beta e caracteriza-se por uma incapacidade progressiva na secreção de insulina, que não acompanha o aumento de glicose em circulação, dando origem a uma hiperglicémia mais grave que o subtipo GCK. O gene HNF1B, localizado no cromossoma 17 (17q12), codifica um fator de transcrição (hepatocyte nuclear factor 1beta - HNF1B) que atua como homodímero ou heterodímero, com HNF1A. O gene HNF1B produz três isoformas - 1, 2 e 3 - e é expresso no timo, pulmão, rim, fígado, pâncreas, estômago, intestino e trato genital. Este fator de transcrição, que integra a mesma rede regulatória que HNF1A, actua no desenvolvimento embrionário do pâncreas e do rim. A diabetes tipo MODY, subtipo HNF1B, resulta de mutações em heterozigotia no gene HNF1B e em cerca de 50% dos casos caracteriza-se por uma combinação de resistência à insulina e disfunção das células beta, exibindo, à semelhança do subtipo HNF1A, uma incapacidade na secreção de insulina em resposta a concentrações crescentes de glicose. Mutações neste gene podem também resultar em anomalias extra pancreáticas e afetar tecidos como o trato genital ou o fígado, sendo quistos renais o fenómeno mais observado. Neste estudo, foram recolhidas informações clínicas acerca de 39 indivíduos, 24 probandos e 15 familiares, através de questionários enviados por vários médicos de diferentes hospitais portugueses. Com base nestas informações, como glicémia em jejum, prova de tolerância à glicose oral e HbA1c, e no diagnóstico clínico de diabetes tipo MODY, foram-nos referenciados indivíduos com uma história familiar de diabetes que evidencie um padrão hereditário dominante; sem autoanticorpos pancreáticos; com início de sintomas antes dos 25 anos; e índice de massa corporal maioritariamente normal. Estes 24 probandos foram estudados por sequenciação de Sanger para os genes GCK e HNF1A, tendo sido também efetuada a pesquisa de inserções e deleções através da técnica MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). Entre substituições pontuais e pequenas deleções, a sequenciação de Sanger detetou 46 variantes genéticas, 19 no gene GCK e 27 no gene HNF1A. Entre estas, seis podem ser classificadas como patogénicas ou provavelmente patogénicas, sendo quatro no gene GCK e duas no gene HNF1A. As variantes patogénicas ou provavelmente patogénicas detetadas no gene GCK foram c.364C>T (p.(Leu122Phe)), uma alteração missense no exão 4 que cosegrega com diabetes e está associada à diabetes tipo MODY; c.579+1_579+33del, uma deleção de 33 pares de base no intrão 5 que elimina um local de splicing e também está associada à diabetes tipo MODY; c.766G>A (p.Glu256Lys), uma alteração missense no exão 7 que induz alterações conformacionais no enzima GCK, reduzindo a sua capacidade de ligação à glicose e subsequente atividade catalítica; e, finalmente, c.1268T>A (p.(Phe423Tyr)), uma alteração missense no exão 10 que cosegrega com diabetes e está associada à diabetes tipo MODY. Estas variantes foram encontradas num total de quatro probandos e cinco familiares. No gene HNF1A, as variantes patogénicas detetadas foram c.814C>T (p.(Arg272Cys)), uma alteração missense no exão 4 que cosegrega com diabetes e impede o fator de transcrição HNF1A de se ligar ao DNA, perdendo assim a sua atividade reguladora na expressão genética; e c.872del (p.(Pro291Glnfs*51)), uma deleção também localizada no exão 4 que provoca uma alteração na grelha de leitura, cosegrega com diabetes e possivelmente resulta de um fenómeno de splippage aquando da replicação de DNA, prevendo-se que resulte numa proteína truncada. Estas variantes foram encontradas num total de três probandos e três familiares. A técnica MLPA foi aplicada na investigação de inserções e deleções em 17 probandos. Três destes probandos geraram resultados sem qualidade, sendo necessárias novas amostras para eventual repetição. Noutros 11 nenhuma inserção ou deleção foi detetada. Nos restantes três probandos foram detetadas duas deleções patogénicas: deleção em heterozigotia dos exões 5 a 8 do gene GCK (c.484-?_1019+?del) num probando; e deleção em heterozigotia do gene HNF1B (c.1-?_1674+?del) em dois probandos. A deleção no gene GCK deverá produzir uma proteína não funcional para gerar o fenótipo MODY, subtipo GCK. No entanto, não foi encontrada qualquer informação sobre esta deleção ou o seu efeito na proteína, pelo que poderemos estar na presença de uma nova mutação. Quanto à deleção do gene HNF1B, estas são frequentes e existem várias fontes que apontam deleções completas do gene como patogénicas, que muitas vezes incluem outros genes na mesma região (17q12). Um dos probandos aparenta não ter história familiar de diabetes e, sendo mutações de novo frequentes, é possível que estejamos na presença de uma. No entanto, não haviam amostras de familiares para fazer estudos de cosegregação nestes dois probandos. A hemizigotia provocada por esta deleção deve resultar em MODY, subtipo HNF1B, por haploinsuficiência. Nenhum destes dois probandos aparenta ter anomalias renais. No total, entre 24 probandos, este estudo identificou 10 indivíduos com MODY, cinco do subtipo GCK, três do subtipo HNF1A e dois do subtipo HNF1B, realçando assim a importância de um diagnóstico correto, com recurso a ferramentas de genética molecular, uma vez que estes indivíduos tinham diagnósticos de diabetes tipo 1 ou tipo 2. Dos restantes 14 probandos sem qualquer variante patogénica/provavelmente patogénica, foi detetada pelo menos uma variante associada a diabetes tipo 2. A utilização destas técnicas no âmbito do diagnóstico genético permite estabelecer o diagnóstico correcto, com implicações para a terapêutica a administrar e qualidade de vida dos utentes dos serviços de saúde.Initially described by Tattersall in 1974, maturity-onset diabetes of the young (MODY) is a form of early onset monogenic diabetes characterized by clinically heterogeneous phenotypes with autosomal dominant inheritance that generally result in β-cell dysfunction. Often misdiagnosed, MODY accounts for 0.6-2% of diabetes cases in Europe and 13 genes have been implicated in this form of diabetes, with heterozygous mutations in GCK and HNF1A being the most common etiologies, followed by heterozygous mutations in HNF4A and HNF1B. Glucokinase (GCK) is a monomeric enzyme that acts as a cellular glucose sensor, playing a role in glycogenesis and glycolysis in hepatocytes, and in insulin release in β-cells. Heterozygous loss-of-function mutations in GCK decrease enzymatic activity and result in GCK-MODY, characterized by asymptomatic mild stable hyperglycemia present from birth. HNF1A-MODY is associated with impaired β-cell proliferation and is characterized by a progressive insulin secretory defect, resulting in a more severe hyperglycemia. This form of MODY is caused by heterozygous mutations in HNF1A, a gene that codes hepatocyte nuclear factor 1 alpha, a homodimeric transcription factor that regulates gene expression in embryonic development and plays a role in insulin expression and β-cell proliferation and death. Hepatocyte nuclear factor 1 beta (HNF1B) is also a transcription factor that acts as a homodimer, or a heterodimer with HNF1A. HNF1B is part of the same regulatory network as HNF1A and regulates embryonic pancreatic development, also playing a role in nephron development. Heterozygous HNF1B mutations result in HNF1B-MODY, characterized by a combination of β-cell dysfunction and insulin resistance in approximately 50% of mutation carriers. Like in HNF1A-MODY, insulin secretion is compromised as glucose concentrations rise. Renal cysts are common. Clinical data on 24 probands and 15 relatives was collected through questionnaires sent by physicians. Subjects with a clinical diagnosis of MODY - family history of diabetes consistent with dominant inheritance pattern, no pancreatic autoantibodies, onset before 25 years of age and typically lean - were referred to this study by physicians for genetic screening via Sanger sequencing (for GCK and HNF1A) and Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA). Between point substitutions and small deletions, Sanger sequencing detected 46 variants, 19 in GCK and 27 in HNF1A. Six of these were pathogenic or likely pathogenic, four in GCK and two in HNF1A. GCK pathogenic or likely pathogenic variants were c.364C>T (p.(Leu122Phe)), in exon 4; c.579+1_579+33del, in intron 5, abolishing the donor splice site; c.766G>A (p.Glu256Lys), in exon 7, which induces conformational changes, decreasing glucose binding and catalytic activity; and c.1268T>A (p.(Phe423Tyr)), in exon 10. These variants were detected in four probands and five relatives. HNF1A pathogenic variants were c.814C>T (p.(Arg272Cys)), which renders HNF1A unable to bind DNA and exert its transactivating activity; and c.872del (p.(Pro291Glnfs*51)), predicted to produce a truncated protein and likely the result of replication slippage. Both variants are located in exon 4. These variants were detected in three probands and three relatives. MLPA analysis detected two pathogenic deletions: a heterozygous GCK exons 5 through 8 deletion (c.484-?_1019+?del) in one proband; and a heterozygous HNF1B deletion (c.1-?_1674+?del) in two probands. The seemingly unreported heterozygous GCK exons 5 through 8 deletion, which should result in a null variant that decreases overall enzymatic activity, could be a novel mutation. Heterozygous HNF1B deletions should result in HNF1B-MODY via haploinsufficiency. One proband had no apparent family history but de novo mutations are frequent. Both probands had no apparent renal abnormalities. Among 24 probands, this study identified a total of 10 MODY cases, with five being GCK-MODY, three being HNF1A-MODY and two being HNF1B-MODY. Of the remaining 14 probands without any detected pathogenic/likely pathogenic variants, 11 had at least one type 2 diabetes associated variant. Hence, this study highlights the importance of genetic diagnosis in patients with diabetic phenotypes consistent with MODY, as a correct diagnosis impacts patient treatment and quality of life