Estimativa e otimização da incerteza em análises qualitativas: identificação de substâncias dopantes em matrizes biológicas

Tese de mestrado, Química (Química) Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017A dopagem é tão antiga como o próprio desporto e constitui um perigo para a saúde dos atletas que a ela recorrem, assim como viola o espírito desportivo. A avaliação da utilização indevida de substâncias dopantes pelos atletas pode envolver a pesquisa direta da substância ativa ou dos seus metabolitos nos fluídos biológicos do atleta, sendo que maioria dos casos a simples presença da substância proibida é considerada uma infração. A fiabilidade deste tipo de análises é crucial para a luta contra a dopagem e pode ser quantificada na forma da incerteza do resultado do “exame” / “análise qualitativa”. A incerteza da identificação da presença de uma substância numa amostra de fluído biológico de um atleta pode ser apresentada como as probabilidades do resultado “positivo” ser verdadeiro ou falso (i.e., taxas de verdadeiros, TP, ou falsos, FP, positivos) ou combinando estes dois parâmetros numa métrica designada razão de verosimilhança, LR, (LR=TP/FP) deduzida a partir do Teorema de Bayes. Caso exista um conhecimento sólido prévio sobre a probabilidade do analito estar presente no fluído biológico analisado, pode também ser reportada a probabilidade a posteriori do resultado positivo estar correto (P(X|e)). Uma das técnicas analíticas mais populares para a identificação de substâncias dopantes em amostras biológicas, após pré-tratamento adequado, é a GC-MS/MS. A identificação de analitos por esta técnica é baseada na concordância dos tempos de retenção, TR, e razões de abundâncias iónicas, RA, entre um pico da amostra e o pico do analito observado num material de referência (i.e., no controlo positivo). A Agência Mundial Antidopagem (WADA), define critérios para a concordância dos parâmetros usados na identificação dos analitos baseada num conhecimento geral do desempenho desta instrumentação. No entanto, estes critérios podem produzir taxas elevas de falsos negativos, FN, sempre que os analitos têm de ser pesquisados próximos do Limite de Deteção. No presente trabalho foi desenvolvida uma ferramenta computacional implementada numa folha de cálculo de MS-Excel que define critérios estatísticos para os parâmetros usados na identificação de analitos e tem em conta o desempenho experimental observado, a distribuição não normal e a correlação das variáveis de entrada dos parâmetros estudados. Esta folha de cálculo recorre a simulações Monte Carlo de tempos de retenção e abundâncias iónicas correlacionadas. A ferramenta desenvolvida permite também avaliar a adequação dos critérios de identificação de analitos definidos pela WADA, nomeadamente as taxas de TP e FN produzidas. Foram igualmente desenvolvidos modelos do ruído do sinal instrumental do espectrómetro de massa que permitem determinar as taxas de FP, impossíveis de determinar experimentalmente, quando se usam critérios estatísticos ou da WADA para a identificação dos compostos. As estimativas de FP e TP associadas aos diferentes parâmetros de identificação foram combinadas e apresentadas como a incerteza do exame na forma de LR ou P(X|e) No contexto das análises de dopagem foram analisadas dez substâncias de várias classes e avaliado o desempenho do exame tendo em conta três critérios de identificação diferentes: o critério estatístico desenvolvido, o critério aplicado no Laboratório de Análises de Dopagem ao procedimento de triagem e o critério de identificação definido pela WADA. As incertezas associadas aos respetivos exames foram calculadas na forma LR e P(X|e), e foi estimada a probabilidade de critérios de identificação estudados não identificarem a presença do analito (taxa de FN). Os resultados obtidos permitem afirmar que a análise instrumental de todas as substâncias, aplicando os critérios definidos e estudados, produz resultados positivos com elevada probabilidade de estarem corretos. No entanto, nalguns dos casos, os critérios de identificação propostos pela WADA produzem taxas elevadas de FN. Desta forma, a ferramenta computacional desenvolvida pode ser muito útil para auxiliar a utilização dos critérios de identificação regulamentados pela WADA, nomeadamente estimando a probabilidade do resultado negativo ser falso, o que pode indicar a necessidade da realização de exames replicados ou complementares.Doping is as old as sports itself and its growth represents a major problem since it harms athletes’ health and violates fair play. The assessment of the misuse of doping substances by athletes may involve the direct search of the active substance or its metabolites in the athlete's biological fluids, and in most cases the mere presence of the prohibited substance is considered an infringement. The reliability of this type of analysis is crucial for the fight against doping and can be quantified in the form of uncertainty of the "examination" / "qualitative analysis" result. The identification uncertainty of the presence of a substance in an athlete biological fluid sample can be presented as the probabilities of the "positive" result being true or false (ie, true, TP, or false, FP, positive) or as the combination of these two parameters in a metric called the likelihood ratio, LR, (LR = TP / FP) deduced from the Bayes’ Theorem. If there is a prior solid knowledge about the probability of the analyte being present in the biological fluid analyzed, the a posteriori probability of the positive result may also be reported (P (X | e)). One of the most popular instrumentations for the identifications of doping agents in athletes’ biological samples, after adequate pre-treatment, is GC-MS/MS. Analytes are identified by the agreement between retention times, RT, and ion abundance ratios, AR, of their mass spectrum observed in samples and calibrators. The World Anti-Doping Agency (WADA) defined criteria for the agreement of identification parameters based on a general knowledge of instrumental performance. However, these criteria may produce high false negative rates, FN, whenever the analytes have to be screened near the Detection Limit. In the present work, a computational tool implemented in na MS-Excel spreadsheet was developed that allows the definition of statistical criteria for the parameters used in analytes identification and that takes to account the observed experimental performance, the non-normal distribution and the correlation of the input variables of the studied parameters. This worksheet uses Monte Carlo simulations of retention times and correlated ion abundances. The developed tool also allows the evaluation of the adequacy of analytes identification criteria defined by WADA, namely the TP and FN rates produced. It was also developed models of the instrumental signal noise of the mass spectrometer to determine the FP positive rates, which can not be experimentally determined, when using statistical or WADA criteia for compounds determination. The FP and TP estimates associated to diferente identification parameters were combine and presented as the unertainty of the examination in the form of LR or P(x|e). In the context of the doping analyzes, ten substances of various classes were analyzed and the performance of the examination was evaluated taking into account three different identification criteria, the developed statistical criterion, the criterion applied in the Laboratório de Análises de Dopagem to the screening procedure and the identification criterion defined by WADA. The uncertainties associated with the respective examinations were also calculated in the form of an LR and P(X|e), and the probability of the studied identification criteria not detect the analyte presence (FN rate). The obtained results allows us to affirm that the instrumental analysis of all the substances, applying the defined and studied criteria, produces positive results with a high probability of being correct. However, in some cases, the identification criteria proposed by WADA produce high FN rates. The developed computational tool can then be very useful to support the use of WADA regulated identification criteria, namely estimating the probability of the negative result being false, which may indicate the need to perform replicated or complementary exams