Characterization and expression of subtilases involved in grapevine resistance to Plasmopara viticola

Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017A videira (Vitis vinifera L.) é a planta de fruto mais cultivada em todo o mundo devido à sua importância económica na indústria vinícola. A sua área de cultivo mundial atinge os 7,5 milhões de hectares com uma produção de 75,8 milhões de toneladas em 2016, sendo a União Europeia líder na produção mundial de vinho (OIV, 2017). Atualmente, uma das grandes ameaças para a indústria vinícola é o míldio da videira, doença causada pelo oomycete obrigatório Plasmopara viticola que afeta todas as castas de Vitis vinifera frequentemente usadas na produção de vinho. No seu ciclo de vida, o P. viticola hiberna sob a forma de oósporos, estas estruturas são altamente resistentes às condições climáticas adversas, podendo conservar a sua vitalidade durante 2 anos. Sob condições adequadas (temperatura entre os 22-25ºC e humidade elevada) os oósporos germinam, dando origem a zoosporângios que libertam zoósporos que germinam e penetram através dos estomas. Na página superior da folha surgem manchas translúcidas e oleosas coincidentes com o aparecimento de um enfeltrado de micélio branco na página inferior levando ao aparecimento de infeções secundárias. Se não forem utilizadas medidas de controlo apropriadas esta doença pode levar a perdas avultadas durante a época de cultivo. Atualmente, as estratégias de controlo da doença assentam exclusivamente na aplicação preventiva de fitoquímicos durante a época de cultivo, acarretando problemas ambientais graves. O conhecimento profundo dos mecanismos de resistência das plantas resistentes a infeção por Plasmopara vitícola é importante para definir métodos alternativos de controlo. Em estudos anteriores a interação entre a videira e o P. viticola foi caracterizada por uma abordagem de biologia de sistemas. Uma análise detalhada das diferenças entre a resposta de genótipos suscetíveis (interação compatível) e resistentes (interação incompatível) a este patogénio, ao nível da transcritómica, metabolómica e proteómica, permitiu a identificação de mecanismos e de candidatos associados ao estabelecimento da interação incompatível. Um dos candidatos é uma subtilisin-like protein, também denominada subtilase. As subtilases são proteases serínicas que exercem funções altamente específicas no desenvolvimento das plantas e em cascatas de sinalização. Na década passada, vários estudos realçaram o papel das subtilases na resposta de defesa a agentes patogénicos nomeadamente no reconhecimeno dos efetores dos patogénios, sinalização e ativação de uma resposta imunitária da planta. Apesar do mecanismo de acção das subtilases associadas à resposta de defensa contra patogénios não estar ainda elucidado, estudos recentes em plantas modelo como a Arabidopsis e o tomate identificaram a prosistemina (o precursor da sistemina) como o substrato das subtilases durante a ataque por herbívoros e/ou por patógenos. A sistemina é um polipeptídeo com 18 resíduos de aminoácidos ativo presente em concentração muito baixas, que actua na via sinalizadora octadecanóide responsável pela biossíntese do ácido jasmónico (JA). O JA é uma fitohormona vegetal associada a mecanismos de resposta a stress biótico, nomeadamente por patógenios necrotróficos ou herbivoria. Muito recentemente, estudos do nosso grupo de investigação demonstraram o envolvimento do JA na resposta da videira ao patogénio biotrófico Plasmopara viticola. A sistemina, como substrato das subtilases foi inicialmente isolada das folhas de tomate Lycopersicum esculentum Mill., sendo demonstrado que quando uma folha é ferida por herbivoria ou mecanicamente, os genes codificadores de sistemina são expressos, transcritos e rapidamente transportados via floema para outras partes da planta ainda intactas. A sistemina atua sobre cinases proteicas activadas por mitogénio, levando à ativação de fosfolipases e consequente libertação do ácido linoléico das membranas plastidiais. O ácido linoléico é utilizado na síntese do JA que regula, via feedback positivo, a expressão génica da prosistemina. O ácido jasmónico produzido move-se através do sistema vascular onde alcança folhas intactas, desencadeando o processo de defesa. Em estudos anteriores, a família de subtilases de videira foi caracterizada e candidatos putativamente associados à resposta de defesa da videira à infeção com o Plasmopara viticola foram identificados. Com o presente trabalho pretende-se validar o envolvimento desses candidatos na resposta de defesa da videira ao P.viticola, avaliar a sua relação com a elicitação por fitohormonas (JA e ácido salicílico (SA)), e selecionar um candidato para validação funcional. A expressão de 5 genes que codificam as subtilases VviSBT3.19 Isoforma X2, VviSBT5.3a, VviSBT4.19 Isoforma X1, VviSBT3.20, VviSBT3.21 Isoforma X1, previamente identificadas como candidatos associados à resistência da videira ao P. viticola foi avaliada por Reação de Polimerização em cadeia em tempo real (qPCR). A sua expressão foi avaliada em dois genótipos de videira, suscetível e resistente ao P. viticola, após inoculação com o patogénio e elicitação com JA e SA. A expressão das subtilases VviSBT5.3a e VviSBT4.19 é aumentada nas primeiras horas (6h), tanto após inoculação como também após elicitação por JA no genótipo resistente, sugerindo o seu envolvimento na resposta imunitária da videira ligada à sinalização por JA. O gene VviSBT4.19 foi selecionado para uma caracterização molecular e funcional de forma a elucidar a sua estrutura e função na resistência da videira ao P. vitícola. A região codificante do gene VviSBT4.19 foi amplificada usando oligonucleótidos específicos para a mesmo. Posteriormente foi efectuada a clonagem da região codificante desta subtilase num vetor de propagação (pJET1.2/blunt) e subsequentemente no vetor de expressão (pET28a(+)). A clonagem e a expressão foram feitas em bactérias adequadas para cada etapa nomeadamente, E. coli TOP10 para clonagem, E. coli BL21codão+ e Turner para expressão. A produção da proteína recombinante foi feita pela adição de β-D-1-tiogalactopiranosideo isopropílico (IPTG). Na análise por eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE), não foi possível observar nenhuma banda correspondente à massa molecular da proteína de interesse para a abordagem de indução de expressão aplicada. Para confirmar se o não aparecimento da banda da proteína de interesse no gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sódio era devido a baixa expressão ou ausência da mesma, a expressão da proteína recombinante foi analisada por dot blot, uma técnica análoga a western blot, utilizando anticorpos anti-caudas de histidina, porque a proteína de interesse estava em fusão com resíduos de histidina na região N-terminal. Duas das cinco bactérias Turner induzidas por adição de IPTG foram reconhecidas pelos anticorpos. A determinação da estrutura desta subtilase é fundamental para a compreensão da sua importância e função na resistência da videira ao P. viticola. No momento, estamos a tentar otimizar as condições de expressão e do western blot para ultrapassar os problemas ligados a produção da proteína recombinante e interacção entre a mesma e anticorpos, para poder prosseguir com a purificação da mesma, identificação através da espectrofotometria de massa e posterior estudo da atividade enzimática. Se estes problemas de expressão persistirem vamos seguir uma nova abordagem de expressão que consistirá no uso de vetores eucariotas específicos para expressão e sistemas de expressão eucariotas que foram anteriormente descritas para expressão de subtilases de plantas nomeadamente, células de insetos, usadas na expressão da subtilase de tomate LeSBT1 e sistemas de cultura em suspensão usada na expressão da outra subtilase de tomate denominada LeSBT3. Estes sistemas são mais adequados para a expressão de subtilisinas quando comparados aos vetores ou sistemas de origem procariotas.One of the most important fruit plant cultivated worldwide is grapevine (Vitis vinifera L.), mainly due to its economic importance in the wine industry. In 2016 the world area under vines was 7.5 million hectares representing a production over 75.8 million tones, being the European Union the leading producer of wine (OIV, 2017). The domesticated grapevine is highly susceptible to downy mildew caused by the obligatory oomycete Plasmopara viticola. This pathogen affects the leaves and shoots, being downy mildew disease characterized by the presence of oil spots on the surface of leaves and white down that can be seen on the underside of the leaves, canes and bunches in periods of high humidity. This disease results in great losses in entire vineyards when control measures are not implemented. The current disease control strategies include the massive use of fungicides, which are very prejudicial to human health. A deeper understanding of the resistance mechanisms is crucial to define alternative control methods. Subtilisin-like proteases (subtilases) belong to a large group of serine proteases present among all organisms such as archaea, bacteria, eukarya, fungi and yeast. My research group has previously characterized the grapevine subtilase gene family, highlighting the involvement of some subtilases in P. viticola resistance. The action mechanisms of subtilases involved in plant defense against pathogens are still unknown; however recent studies have identified prosystemin as the subtilase SBT3 substrate and highlighted the role of the processed systemin in the octadecanoid pathway for jasmonic acid (JA) biosynthesis. In the present work, we have selected 5 subtilase genes namely, VviSBT3.19 Isoform X2, VviSBT5.3a, VviSBT4.19 Isoform X1, VviSBT3.20, VviSBT3.21 Isoform X1, and analysed their expression in two Vitis genotypes (resistant and susceptible to downy mildew), after inoculation with P. viticola and elicitation with either JA or salicylic acid (SA). Our results showed that the expression of VviSBT5.3a and VviSBT4.19 increase after both P. viticola inoculation and JA elicitation in resistant grapevine genotype in the first hours after inoculation and elicitation. These results suggest subtilases’ involvement in the grapevine immunity. The grapevine subtilase VviSBT4.19 was selected for further functional characterization aiming to unravel its structure and function The VviSBT4.19 coding sequence was isolated and cloned into both propagation vector (pJET1.2/blunt) and expression vector (pET28a(+)). Two bacteria strains, E. coli BL21codon plus and Turner, were tested for recombinant protein production. VviSBT4.19 expression was tested by induction with IPTG. Although the SDS-PAGE gel did not show a band corresponding to the VviSBT4.19 protein size, a dot blot analysis was performed. Anti-poly-His-tag antibodies were used and a positive result was obtained for IPTG induction. The determination of this subtilase structure will be crucial to understand its importance and function in grapevine resistance against P. viticola