Characterization of cell death in the ex vivo slice model of epileptogenesis

Tese de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017Mais de 50 milhões de pessoas a nível mundial estão diagnosticadas com epilepsia, uma doença cerebral caracterizada por recorrentes e imprevisíveis interrupções da actividade cerebral normal, designadas por convulsões. Como qualquer doença neurológica, a epilepsia tem associado a si uma gama de consequências neurobiológicas, sociais, comportamentais e cognitivas. Atualmente, ainda não foi encontrada uma cura para esta enfermidade. Apesar dos muitos fármacos antiepilépticos, estes revelam-se ineficazes em cerca de 30% dos casos. Nos últimos anos, a contribuição da inflamação nesta doença tem sido amplamente estudada, dado que contribui para a geração e recorrência dos ataques epilépticos, bem como para a sua progressão. Os mediadores inflamatórios têm vindo a ser descritos como sendo produzidos pela microglia activada e astrócitos, assim como por neurónios. Um mecanismo de reciprocidade também tem sido sugerido entre a inflamação e a epilepsia. A primeira pode ser tanto uma causa como uma consequência das crises epiléticas, além de ser a causa do desenvolvimento de epilepsia após o evento epilético inicial. Estudos têm demonstrado uma ligação entre os eventos inflamatórios e a morte neuronal ocorrente na epilepsia, bem como a ativação da glia e a expressão de mediadores inflamatórios. Em particular, as células da glia (astrócitos e microglia) produzem e libertam citocinas pró-inflamatórias, que têm efeitos na excitotoxicidade e na morte neuronal, sendo estes factores caracterizantes da epileptogénese. Este trabalho focou-se nas citocinas Interleucina 1β (IL-1β) e no Factor de Necrose Tumoral α (TNF-α), principalmente na sua contribuição para alguns dos processos de morte celular que acontecem nesta patologia neurológica. Este estudo teve como objectivo principal descodificar a contribuição de cada mecanismo de morte celular envolvido num modelo de epileptogénese em fatias organotipicas de rato. Trata-se de um modelo confiável onde já foi demonstrada a ocorrência de actividade epiléptica espontânea e que permite que as células se desenvolvam de forma semelhante ao que aconteceria in vivo. As fatias podem ser mantidas durante mais de um mês para manipulação e avaliação a longo prazo. Este modelo de epileptogénese é considerado uma fiel reprodução do que é descrito em pacientes com epilepsia, o que o torna apto para a sua avaliação. As culturas foram preparadas a partir de ratos Sprague-Dawley com 6-7 dias de vida. Os ensaios foram realizados a 0, 3, 7, 10, 14, 17 e 21 dias in vitro (DIV), de modo a estudar os marcadores de morte celular e de inflamação ao longo do tempo. O especial foco esteve nos diversos mecanismos de morte celular, monitorizando também a ativação e morfologia dos astrócitos e da microglia, e a produção das principais citocinas pró-inflamatórias envolvidas em epilepsia. No decorrer da última década, também o inflamassoma NLRP3 tem vindo a ser referido como tendo um papel na resposta imunológica. Tendo já sido descrito no sistema nervoso central, o inflamassoma NLRP3 é produzido em altos níveis pela microglia e é o mais importante regulador da ativação da caspase1. A clivagem pela caspase1 leva à maturação de IL-1β e assim à indução de fenómenos inflamatórios. Este mecanismo é um dos que descreve a piroptose, uma das vias de morte celular estudada neste projecto. A piroptose é o maior exemplo de morte celular relacionada com a inflamação e é principalmente caracterizada pela formação do inflamassoma NLRP3. A consequente produção e excreção de IL-1β poderá influenciar as células em seu redor de forma adversa, podendo levar à rutura da barreira hematoencefálica. Outra via que leva a cascatas inflamatórias é a necrose, onde ocorre um efetivo derrame de conteúdos celulares devido ao aumento do volume dos organelos. Essa rutura liberta moléculas que iniciam cascadas inflamatórias. Também foi realizada uma avaliação da autofagia. Normalmente com um papel protetor, a autofagia pode contribuir para a morte celular em condições de grande stress, onde se verifica a formação de estruturas – autofagossomas – que se fundem com lisossomas, libertando produtos tóxicos que se acumulam no citoplasma das células saudáveis, levando a degradação das mesmas. Por último, a apoptose também engloba um empacotamento de componentes internos, que de outra forma iniciariam uma resposta imune, para eliminação fagocitária. A morte celular foi primariamente avaliada por western blotting. A marcação pelo NLRP3 e pelo ASC permitiu averiguar a expressão dos mecanismos de piroptose, sendo coligados à produção de IL-1β avaliada por ELISA. O marcador LC3 foi usado para averiguar os mecanismos de autofagia, mais precisamente a formação dos autofagossoma, estruturas altamente específicas deste tipo de via. Os produtos de clivagem da αII-espetrina (SBDP) forneceram mais detalhes sobre as vias de morte celular por necrose e por apoptose. A marcação por caspase3 foi também utilizada como recurso para averiguação da apoptose, bem como a avaliação da produção de TNF-α por ELISA. Os ensaios de imunofluorescência foram efetuados para avaliar as alterações morfológicas das células da glia, astrócitos e microglia, utilizando marcadores específicos, GFAP e Iba1, respetivamente. Tal procedimento é justificado pelo facto de a morfologia destas células ser indicadora de um estado de ativação, que leva astrócitos e microglia a atuar como mediadores de inflamação, produzindo e excretando citocinas inflamatórias que irão manter o ciclo de inflamação, crises e morte celular. Devido ao severo trauma que se sabe que este modelo apresenta para as fatias de hipocampo, já era de esperar uma robusta degeneração neuronal iniciada após quatro horas do procedimento e que se poderia alastrar até 7 DIV. A necrose foi a via de morte celular mais evidente até este dia, seguindo-se uma possível contribuição da piroptose. Os resultados obtidos mostraram-se mais preponderantes a partir de 14 DIV, aquando do aparecimento de atividade interictal (previamente estudado), revelando-se num aumento da expressão dos marcadores de morte celular responsáveis pela manutenção dos eventos inflamatórios que caracterizam a epilepsia ao longo do tempo. Os resultados combinados da expressão do NLRP3, ASC e dos níveis de IL-1β produzidos sugerem que a crónica produção de elementos inflamatórios pode levar à morte por piroptose. Também a contribuir para o ciclo da inflamação, a necrose parece ter especial relevância nas etapas finais da epileptogénese. A apoptose e a autofagia parecem não ter um papel relevante neste modelo, sendo que os seus marcadores foram observados em pouca expressão ou, comparando entre condições, não ofereciam qualquer conclusão relevante. Para conclusões mais definitivas em relação à autofagia, mais testes com outros marcadores teriam de ser efetuados. Em relação à apoptose, também não foram detetados níveis díspares de TNF-α em fatias epiléticas. A ativação das células da glia também se alterou ao longo da epileptogénese. Os astrócitos demonstraram um fenótipo “saudável” a 7 DIV e um fenótipo ativado a 21 DIV, contrariamente à microglia que alterou de uma morfologia ativada para não-ativada ao longo do tempo. Estes resultados permitem extrapolar que os astrócitos podem ser os responsáveis pelo contexto inflamatório em estadios mais avançados da epilepsia, e muito provavelmente perpetuarem os elevados níveis de NLRP3, ASC e IL-1β. Sumarizando, este trabalho permitiu elucidar os mecanismos de morte celular ao longo da epileptogénese, possibilitando igualmente inferir sobre a contribuição das células da glia nesta patologia.Approximately 50 million people worldwide have epilepsy. In the last decade, several studies demonstrated that the production of inflammatory mediators (cytokines) by activated microglia, astrocytes and neurons in epileptogenic tissue, leads to neuroinflammation. Moreover, recent studies show that NLRP3 inflammasome also drives inflammation in the CNS, particularly in this neurological disorder. Cell death can occur due to the increase of the internal excitotoxicity. This study was performed in an ex vivo model of epileptogenesis in organotypic slices and aimed to disclosure the main pathways involved in cell death and its contribution to epileptogenesis. An evaluation of cell death was performed through αII-spectrin cleavage assessment and by caspase3, LC3, ASC and NLRP3 protein expression. Astrogliosis and microglia activation was assessed by immunohistochemistry, with the use of specific markers, namely glial fibrillary acidic protein (GFAP) for astrocytes and ionized calcium-binding molecule 1 (Iba1) for microglia. Also, ELISA assay was carried out to quantify the production of TNF-α and IL-1β. Assays were carried out in slices with 0, 3, 7, 10, 14, 17 and 21 DIV to fully cover the course of epileptogenesis. The initial cell trauma caused by massive deafferentation and deefferentation, which occurred during tissue slicing, resulted in enhanced SBDP145/αII-spectrin and NLRP3 levels during the first week in vitro, suggesting a strong role for necrosis and a possible role for pyroptosis during this phase. More relevant results emerged from the high production of NLRP3, ASC and IL-1β at 14 DIV, parallel with the initiation of epileptic-like events, reinforcing the idea of a strong inflammatory component in later stages of epileptogenesis and a consequent role for pyroptosis in this model. Autophagy and apoptosis do not seem to play a role in this model, since there were no significant differences for their markers, LC3 and caspase3, respectively. In what concerns apoptosis, also no change in TNF-α production was observed. The activation state of glial cells also changed within epileptogenesis progression. Astrocytes display a “healthy” phenotype at 7 DIV and an activated one at 21 DIV, while microglia changes from an activated to a resting morphology over time. These results reinforce that astrocytes are the ultimate responsible for the inflammatory environment in late epileptogenesis, possibly being the perpetuator for the chronic levels of NLRP3, ASC and IL-1β. In summary, this work enlightened the mechanisms of cell death along epileptogenesis, together with an assessment of glia cells contribution for this pathology