Mimetics of donepezil as potential hybrid drugs against Alzheimer's disease - synthesis and biochemical evaluation

Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disorder and the biggest cause of senile dementia, among the elderly population. Currently, almost all the drugs approved by the Food and Drug Administration (FDA) for AD treatment function as acetylcholinesterase inhibitors (AChEI), due to low levels of acetylcholine found in AD patients’ brains. However, these drugs can only improve the symptoms of the disease, but don’t interfere with its progress and don’t have any role in the disease cure. AD has proven to have a pathology with several different hallmarks associated with complex biochemical mechanisms, which difficult the understanding of the cause of the disease. Even though, efforts are being made worldwide for the development of potential therapeutic drug candidates for AD treatment. The aim of this thesis is to contribute to the development of drug candidates based on a multi-target approach, involving the design, synthesis and biochemical evaluation of the compounds. The compounds were designed based on the conjugation of donepezil (an AChEI) derivatives and benzimidazole or benzofuran derivatives, to obtain molecules with two different moieties and, consequently, non-toxic multifunctional compounds. Following this approach, six compounds were fully synthesized and studied for their AChE inhibition, antioxidant activity and Aβ aggregation inhibition, with moderate results. Some of the compounds containing a phenol group, were also studied for their in vitro metal chelation capacity. Specifically, hydroxyphenylbenzimidazole derivatives demonstrated good copper(II) and moderate zinc(II) chelating ability. Pharmacokinetic properties were also calculated in view of their possible administration as drugs. Overall, these results provide a set of information that, in association with the molecular modulation study, can give an insight on the capacity of these donepezil mimetics as potential multi-targeting anti-AD agents and also on future suggestion for structural modifications to improve important properties, namely the AChE inhibition and Aβ aggregation. Moreover, two analogue compounds with chelation power towards copper(II) and zinc(II) are in the final stage of synthesis development.A doença de Alzheimer (AD) é uma doença neurodegenerativa progressiva caraterizada pela perda de neurónios no córtex cerebral e regiões subcorticais. É a forma mais comum de demência na população idosa, sendo que os primeiros sintomas podem mesmo ser confundidos com características de idade avançada, como o esquecimento de eventos recentes. Com o avançar da doença, a memória a longo prazo também começa a ficar afetada, e outros fenómenos, tais como alterações de humor e dificuldades com a linguagem, começam a aparecer. Num estádio final, a doença é fatal para o paciente. Num contexto molecular, a AD ainda não é 100% compreensível devido ao envolvimento de diferentes mecanismos bioquímicos. De entre as diferentes caraterísticas da doença podem-se realçar os baixos níveis de acetilcolina, a presença de depósitos extracelulares de placas amiloides, um aumento do stress oxidativo e uma disrupção da homeostase de metais de transição, como o cobre, o ferro e o zinco. Diferentes hipóteses foram propostas para a causa da doença, mas nenhuma com aceitação universal, sendo que as hipóteses com maior apoio são a hipótese colinérgica e a hipótese da cascata amiloide. A primeira admite que a principal causa da perda da função cognitiva está associada a uma degeneração dos neurónios colinérgicos e da sua neurotransmissão, enquanto a segunda assenta na premissa de que a acumulação de proteínas β-amiloides (Aβ) é a principal caraterística da patologia. Atualmente, os fármacos aprovados pela FDA atuam essencialmente com base na hipótese colinérgica, funcionando enquanto inibidores do acetilcolinesterase (AChEI), de forma a bloquear a hidrólise de acetilcolina. No entanto, estes fármacos apenas permitem melhorar os sintomas da doença, permanecendo a doença como incurável. Todos estes fatores levaram à criação de uma nova abordagem para o combate da doença baseada no desenvolvimento de compostos multifuncionais. Em geral, estes compostos são desenvolvidos a partir de uma estrutura já conhecida, de um dos fármacos que atuam como AChEI, os quais são conjugados com diferentes motivos que acrescentem propriedades favoráveis para os pacientes de AD. Com base nesses conhecimentos, o objetivo desta tese foi o desenvolvimento de novas moléculas multifuncionais que pudessem atuar como potencias fármacos para o tratamento de AD. Em particular, foram desenvolvidos compostos a partir da estrutura base do donepezilo, comercializado como Aricept®, um dos fármacos aprovados pela FDA. O donepezilo apresenta na sua constituição uma benzil piperidina que foi usada para o design de novas moléculas, tal como um isóstero benzil piperazina. Estes derivados de donepezilo, foram por sua vez conjugados com derivados de dois tipos de heterociclos, benzimidazol e benzofurano, que por sua vez já são estruturas privilegiadas em química medicinal. O primeiro passo do trabalho foi o design dos compostos que são agrupados em duas séries, uma com um fragmento derivado da piperidina e outra com um derivado de piperazina. Foram sintetizados seis compostos (três por série), com dois compostos para os quais ainda é necessária uma otimização do esquema reacional (apesar de ter sido possível sintetizar um deles, mas em muita baixa quantidade). Os compostos sintetizados foram caraterizados por técnicas de análise elementar, como espectroscopia de ressonância magnética nuclear e espectrometria de massa, posteriormente avaliadas as suas propriedades, com o objetivo de testar a sua potencial utilização para o tratamento de pacientes com AD. Foram feitos estudos de inibição enzimática do acetilcolinesterase, de atividade antioxidante e de inibição da agregação Aβ. Os estudos de inibição enzimática mostraram uma inibição a um nível micromolar, apresentando o composto PZ3 o melhor valor de inibição (4.0 μΜ), enquanto o composto PP2 apresentou o valor mais baixo (30.0 μΜ). Apesar destes valores demonstrarem que os compostos de ambas as séries possuem capacidade inibitória, em comparação com os fármacos de referência, a tacrina e o donepezilo, que inibem a um nível nanomolar, os novos compostos são inibidores mais fracos do enzima. Estes resultados foram racionalizados por modulação molecular, em que a nova molécula é sobreposta sobre um ligando, no centro ativo do enzima. No caso, foi escolhida a estrutura 1EVE da base de dados PDB, uma vez que esta apresenta a molécula de donepezilo enquanto ligando. A conjugação de ambos os dados, esclarece em relação à interação dupla das moléculas, com o centro catalítico e periférico do enzima, mas também permite observar futuras modificações que podem vir a ser benéficas no desenvolvimento deste género de compostos. Uma dessas modificações seria a adição de mais um grupo metileno na série PP, de modo a que as moléculas possam ter um comprimento ideal para uma interação bimodal mais forte. Os estudos de atividade antioxidante não tiveram o mesmo sucesso, uma vez que apenas um dos compostos apresentou atividade, enquanto um dos restantes não pode ser testado devido a problemas de solubilidade. O composto PZ1 apresentou um valor de 594.4 μM, representando uma atividade num nível moderado-baixo, apesar de ser um resultado positivo, dado que a estrutura original do donepezilo não apresenta atividade. Os compostos com derivados de benzofurano não apresentaram atividade antioxidante, mas a síntese de compostos com um grupo hidroxilo na posição de substituição poderá ser um passo para uma estrutura com maior poder antioxidante. Os estudos de inibição da agregação Aβ também apresentaram valores que podem ser considerados moderados-baixos (14.4 – 36.3%), sendo que as moléculas com o hidroxifenilbenzimidazol apresentam melhor capacidade do que as moléculas com os benzofuranos não substituídos (PZ4 sendo uma exceção). Os compostos PZ1 e PZ4 foram também analisados para a inibição da agregação Aβ induzida pelo cobre, dado a presença de uma unidade quelante na sua estrutura. Ambos os compostos apresentaram resultados positivos, com percentagens de inibição superiores à inibição na ausência do metal. Estes estudos foram feitos por técnicas de fluorescência, sendo que a técnica de microscopia de transmissão eletrónica, foi também realizada, enquanto técnica imagiológica, para uma racionalização dos resultados. Como reportado anteriormente, o fragmento molecular hidroxifenilo associado ao grupo amina do benzimidazole, tem potencial para funcionar como quelante. Assim, os compostos que o incluem (PP1 e PZ1) foram também avaliados para a sua capacidade quelante para o cobre e o zinco por titulação potenciométrica. Apesar do composto PP1 não se ter demonstrado solúvel na mistura H2O/DMSO em toda a gama de pH da titulação, o composto PZ1 demonstrou ter um bom potencial quelante para o cobre (pCu = 16.3) e um razoável para o zinco (pZn = 6.4). Por fim, através do programa QikProp, foram calculados alguns parâmetros farmacocinéticos, com especial atenção para potenciais violações da regra de Lipinski, regra esta que indica se determinado composto tem propriedades para ser ativo por administração oral. Nenhum dos compostos estudados apresentou violações a esta regra, representando o seu potencial enquanto possíveis fármacos para administração oral. Apesar de provada a multifuncionalidade dos compostos estudados, os mesmos não se podem considerar excecionais em nenhuma das propriedades individuais. Contudo, estes compostos não deverão ser tóxicos, esperando-se que possa haver efeitos sinergéticos associados ao conjunto das suas propriedades avaliadas. Deste trabalho podem ainda ser inferidas orientações positivas para o desenvolvimento de novos candidatos a fármacos anti-AD. Concretamente, a adição de um grupo metileno na série com piperidina pode vir a ser chave para o estabelecimento de interações mais fortes com o acetilcolinesterase, com consequência obtenção de uma melhor inibição do enzima, enquanto a substituição no benzofurano por um grupo hidroxilo pode vir a originar um composto com boa atividade antioxidante, e também potencial atividade quelante