Metabolism of non-conventional wine yeasts

Tese de mestrado em Microbiologia Aplicada, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017O vinho é um produto com significado cultural e social desde tempos antigos, estando intimamente ligado à história do ser humano e à economia de alguns países. No entanto, a indústria vínica está a ser afetada pelas alterações climáticas, que têm vindo a tornar a produção de vinho conforme os típicos parâmetros comerciais cada vez mais difícil de atingir, enquanto mantendo parâmetros de qualidade segundo a preferência dos consumidores. Estudos a nível mundial confirmam a tendência de aquecimento a nível global das temperaturas climáticas acima das típicas variações normais experienciadas de ano para ano e que induzem o efeito vintage, pequenas variações na qualidade do vinho e rendimento obtido. A subida constante das temperaturas à escala global modificam o potencial de maturação das vinhas, levando à alteração da composição das uvas que se traduz maioritariamente na modificação do conteúdo em taninos e compostos fenólicos, aumento da maturação e maiores concentrações de açúcares. Maiores subidas de temperaturas apontam para maiores aumentos no teor de açúcares no mosto de uva, que apresenta como principal problema para a indústria vínica maiores teores de álcool nos vinhos após fermentação, assim como uma alteração dos atributos sensoriais e da microbiologia vínicas. Teores de etanol acima dos parâmetros comerciais podem impedir a comercialização dos vinhos produzidos. Os elevados teores de etanol obtidos ao fermentar mostos de elevadas concentrações de açúcares devem-se à elevada capacidade fermentativa e de processamento de açúcares das espécies de leveduras utilizadas como culturas fermentativas, que leva a um elevado rendimento no consumo de açúcar e produção de etanol. Elevadas concentrações de álcool favorecem a ocorrência de fermentações incompletas, levando à decomposição do mosto. Além das altas concentrações de etanol, as elevadas temperaturas podem levar a uma menor acumulação de metabolitos cruciais para o desenvolvimento dos perfis organolépticos vínicos durante o desenvolvimento e crescimento das vinhas. Em adição, a actual utilização generalizada de culturas starter para iniciar a fermentação de vinhos na indústria vínica tem conduzido a uma convergência dos perfis sensoriais dos vinhos, que se apresentam cada vez mais constantes e semelhantes entre si, sendo hoje em dia crucial a introdução de maior variedade aromática na maturação dos sabores de vinho para dar continuidade ao desenvolvimento do mercado e à atracção ao consumidor. A utilização das mesmas estirpes de S. cerevisiae para iniciação de fermentações tem-se vindo a manter graças às vantagens que o profundo conhecimento da fisiologia, ciclo de vida, metabolismo, processos de regulação e genoma consensus destas leveduras confere: o poder de controlar o processo fermentativo sabendo exactamente o que esperar que ocorra durante as diferentes fases do mesmo, assim como um conhecimento prévio do produto que se conseguirá obter, assim como das suas características. Várias abordagens têm sido feitas para tentar diminuir os níveis de etanol nos vinhos, nomeadamente abordagens viticulturais, pré-fermentativas e pós-fermentativas. Porém, para enfrentar este problema, é importante ter como alvo não só cada etapa da produção das uvas e da produção de vinho, como também as abordagens microbiológicas, de entre as quais uma opção bastante em aberto e inexplorada é avaliar leveduras não-convencionais na fermentação de vinho e selecção de estirpes com potencial. As leveduras não-convencionais compreendem uma maior variedade fisiológica que as leveduras Saccharomyces. O seu uso vai além da produção de compostos sensorialmente activos, sendo que têm vindo a ganhar crescente interesse para a produção de vinhos com teores de alcóol mais baixos. O objectivo deste trabalho foi caracterizar o metabolismo de duas estirpes de leveduras não-Saccharomyces seleccionadas, Lachancea thermotolerans e Metschnikowia pulcherrima. Para tal, ambas as estirpes foram sujeitas a crescimento numa matriz de mosto sintético sob duas diferentes concentrações de açúcares, assim como duas concentrações diferentes de azoto (total de quatro condições cruzadas). As cinéticas de crescimento de ambas as estirpes (em todos os meios de cultura testados) foram avaliadas antes de prosseguir com os estudos. A estirpe de L. thermotolerans mostrou um crescimento exponencial típico, tendo-se observado que atingiu taxas de crescimento superiores quando em meio de mosto sintético com concentrações mais elevadas de açúcar. Já a estirpe de M. Pulcherrima mostrou taxas de crescimento substancialmente semelhantes em todos os meios de mosto sintético testados, sendo a taxa de crescimento mais elevada (ainda que muito ligeiramente) em condições de elevado açúcar mas níveis mais baixos de azoto. Amostras das culturas foram colhidas ao longo do decurso do crescimento para fingerprinting das estirpes de forma a confirmar a identidade final das estirpes cultivadas antes de prosseguir para as análises de metaboloma. Foi então conduzida uma análise dos metabolitos em diferentes estágios do crescimento seguindo uma abordagem de untargeted metabolomics (análise metabolómica sem alvo específico) utilizando FTICR-MS (espectrometria de massa Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance). Esta técnica de espectrometria de massa é particularmente relevante no estudo de metabolitos graças à sua elevada sensibilidade, precisão (< 1 ppm) e ultra-elevada resolução (superior a 1,000,000). Normalmente, um estudo metabólico é realizado recorrendo a técnicas como a Ressonância Magnética Nuclear (NMR) e Espectrometria de Massa (MS) ou à combinação destas técnicas a processos de separação cromatográficos como a Cromatografia Gasosa (CG) ou Líquida (LC). Contudo, os limites de deteção por NMR são baixos, e apesar da combinação de MS com CG e LC possibilitar a deteção de um elevado número de compostos, os processos cromatográficos demoram muito tempo e normalmente necessitam de vários passos de limpeza do equipamento. Uma solução será então a utilização de Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance acoplado a um espectrómetro de massa (FTICR-MS), visto que é um equipamento que não só combina a elevada resolução com a elevada exatidão de massa, como também permite uma rápida e fácil aquisição de resultados. Foram analisadas amostras recolhidas nos tempos correspondendo ao início da fase exponencial de crescimento e à fase estacionária de crescimento de ambas as estirpes seleccionadas. Após processamento dos espectros em programas de software adequado e recorrendo a páginas e ferramentas online, foi possível gerar uma lista de compostos com a respectiva distribuição dos mesmos dentro de todas as amostras analisadas. Através de uma análise PCA, foi testada a capacidade de agrupamento através dos perfis metabólicos das diferentes amostras. O agrupamento das amostras deu-se não só por estirpe, como também por tempo e fracção analisada, tendo ocorrido uma boa separação das diferentes amostras. Os metabolitos relevantes já estudados e que se sabe contribuir para o perfil organoléptico e aroma do vinho foram seleccionados para revelar vias metabólicas específicas e diferenças metabólicas entre as estirpes de leveduras estudadas nas diferentes condições de crescimento testadas. Estas diferenças encontradas como resultado da diferente composição do meio irão contribuir para a produção de novos vinhos no que toca a sabor e aroma. Duas das vias metabólicas mais relevantes encontradas nestas leveduras e que contribuem para o sabor e o aroma dos produtos vínicos foram o metabolismo do ácido alfa-linolénico e o metabolismo de biossíntese de sesquiterpenóides. Vários metabolitos pertencentes a estas duas vias foram identificados e verifica-se que a sua distribuição ao longo das fracções e tempos estudados se altera não só com a estirpe como também com o meio de cultura utilizado (ou seja, com as condições de açúcares e de azoto utilizadas no crescimento das leveduras). Apesar da presença destes compostos em leveduras não-convencionais necessitar de mais estudos, estes microorganismos pouco estudados parecem estar a revelar o seu potencial na indústria vínica. Este trabalho veio validar a criação de perfis metabólicos e a sua utilização para estudos comparativos deste género através da técnica de FTICR-MS aplicada.Non-conventional yeast species comprehend a wider physiological diversity that the commonly used Saccharomyces yeasts. Their use in wine production goes beyond the production of sensory-active compounds. They have gained interest in the production of wines with increased organoleptic profile and lower alcohol content. This is highly crucial for the wine industry, given the alterations in the grape composition due to climate change. These changes, mainly lower acidity, changes in phenolic and tannin contents, altered maturation, and increased sugar concentration, contribute to increase the alcohol content in wines, modify sensory attributes and wine microbiology. To tackle this problem, it is important to target not only every stage of grape production and winemaking, but also aspects related to microbiological approaches and the selection of non-conventional yeasts for wine fermentation. The goal of this work was to characterize the metabolism of two selected non-Saccharomyces yeasts (Lachancea thermotolerans and Metschnikowia pulcherrima) grown in a synthetic must matrix under different sugar and nitrogen concentrations. Growth was followed for 71 hours, with sample collection at different timepoints. At the end of cell growth, a DNA fingerprinting analysis confirmed the strain’s identity in the culture. Metabolite analysis at different growth stages, in both cells and culture medium, was performed following an untargeted metabolomics approach using Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry (FTICR-MS). Based on the metabolic profiling, the different strains and culture media could be segregated. Relevant metabolites known to contribute to wine flavour and aroma were selected to uncover specific pathways and metabolic differences between the studied yeast strains in the different growth conditions. These differences found so far as a result of the different media compositions will contribute to the production of novel wines, both in flavour and aroma