Single domain antibodies association to lipid-guide drug delivery as an innovative therapeutic strategy against cancer stem cells

Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017O cancro da mama triplo negativo (TNBC) é o tipo de adenocarcinoma que mais interessa aos investigadores e patologistas, uma vez que não responde aos tratamentos cancerígenos mais comuns. Este caracteriza-se pela ausência dos marcadores preditivos, tais como recetores de progesterona (PR) e de estrogénio (ER), que elucidam sobre a resposta de um paciente a uma terapia, e dos marcadores de prognóstico, tais como HER2, cuja presença ou ausência indica o risco de recorrência e mortalidade. Um dos subtipos que nos interessa, e é utilizado neste trabalho, designa-se por tipo mesenquimal. Este tipo de cancro é caracterizado por desenvolver mecanismos que contribuem para a transição epitelial-mesenquimal, tal como a via do PI3K/AKT e mTOR. Para se tornarem células mesenquimais, as junções aderentes e apertadas são destruídas e a E-caderina é degradada. A supressão da expressão de genes epiteliais leva à ativação de genes mesenquimais e à reorganização do citoesqueleto de forma a permitir a migração e invasão celular. Uma das proteínas resultantes desta ativação é a vimentina que, sendo um filamento intermédio, tem a sua função dependente de um ciclo de fosforilação e desfosforilação. Na última década muitos são os papéis associados a esta proteína, nomeadamente manter a integridade celular durante a endocitose e participar na via PI3K/AKT como efetor do PI3K. Por apresentarem características muito semelhantes às células estaminais são geralmente designadas de células cancerígenas tipo estaminais (cancer stem cells – CSCs). Dada a sua capacidade de diferenciação e renovação conseguem reconstituir a heterogeneidade inicial do tumor. As CSCs diferem das restantes células cancerígenas porque estimulam a expressão de recetores membranares, tais como o CD44, e reprimem a expressão de outros, como o CD24. O marcador do fenótipo estaminal destas células mais utilizado é o recetor CD44 e, na nossa opinião, tem o potencial para se tornar um biomarcador no tratamento do cancro. O CD44 é uma glicoproteína transmembranar codificada por 20 exões. A forma mais expressa, e a de menor peso molecular, é a forma standard (CD44s), na qual existe apenas os exões constantes (exões 1-5 e exões 16-18). A inserção dos exões variáveis (exões 5-15 e 19-20) cria isoformas de maior peso molecular e a sua expressão depende do tipo de tecido e do microambiente extracelular. O domínio extracelular deste recetor regula a interação com a matriz extracelular durante a migração celular. A proteólise deste recetor leva à formação de um fragmento solúvel, correspondente ao domínio extracelular, e a um fragmento de 12 kDa, correspondente ao domínio intracelular, que tem a capacidade de se deslocar para o núcleo e ativar a transcrição do próprio gene CD44 e do fator de transcrição Twist. Trata-se de um recetor cuja função tem sido associada a vias de sinalização intracelular, tais como a via PI3K/Akt e MAPK-Ras, que regulam a sobrevivência, proliferação e invasão celular. Um dos obstáculos mais importantes que qualquer fármaco encontra no momento em que alcança uma célula cancerígena é o transportador transmembranar designado de P-glicoproteína (P-gp). Esta bomba de efluxo é ativamente sobre expressa em células cancerígenas e tem a capacidade de transportar fármacos e outro tipo de moléculas contra o seu gradiente de concentração, o que significa que o fármaco quando interage com o domínio transmembranar desta proteína é efluxado para o citoplasma, evitando a sua acumulação no citoplasma, conferindo a estas células um fenótipo de resistência a fármacos (Multidrug Resistance - MDR). Os nanotransportadores são sistemas à escala nanométrica constituídos por pelo menos dois componentes, no qual um deles é o agente ativo (neste trabalho trata-se da salinomicina) e o outro que é responsável pela proteção do agente ativo e o seu transporte (que neste trabalho será o poloxamero). A principal via de entrada destas partículas na célula é através de um processo de endocitose. No caso de partículas de tamanho nanométrico, como as do presente trabalho, são internalizadas por um processo dependente de claterina ou por um processo dependente de caveolae. Endocitose dependente de claterina é o mecanismo de endocitose mediada por recetor mais importante. Quando uma partícula funcionalizada se liga a um recetor membranar específico ocorre o recrutamento de proteínas endocíticas, tais como AP2 e claterina, de modo a se formar uma vesícula (revestida por claterina) que contém as nanopartículas, que se separa da membrana através da ação da dinamina. Uma vez no citosol a claterina é degrada e as vesículas formadas deslocam-se ao longo do citoesqueleto até ao seu organelo alvo. A endocitose mediada por caveolae é o principal mecanismo através do qual os patógenos invadem uma célula e evitam a sua degradação nos lisossomas. As nanopartículas ao interagirem com a membrana induzem a formação de vesículas, que devido à ação da dinamina, destacam-se da membrana e, uma vez no citosol fundem-se com os caveosomas. O objetivo do presente trabalho prendia-se em determinar qual a via de endocitose que as células da mama cancerígenas MDA-MB-231 utilizam para internalizar tanto micelas funcionalizadas como não funcionalizadas. Ao mesmo tempo, queríamos tentar perceber se o nanotransportador proposto protegeria o fármaco encapsulado da ação da P-gp. Havendo uma acumulação intracelular de salinomicina, esta poderia atuar sobre a proteína mesenquimal vimentina - dado o seu carácter tumorogénico - de forma a reduzir a sua expressão e, desta forma reduzir a capacidade de mestastização destas células. Para tal, o primeiro passo foi descobrir qual a concentração que mataria 50% das células, tanto para o fármaco livre como quando se encontrava encapsulado. Estes valores são 5.32 μM e 0.071 μM para a salinomicina encapsulada e livre, respetivamente, às 24 horas, e 51.94 μM e 5.34 μM para a salinomicina encapsulada e livre, respetivamente, às 48 horas. Os valores obtidos para a salinomicina livre estão dentro do intervalo de valores descrito na literatura para este fármaco. Quando funcionalizadas as micelas induzem o aumento da expressão do recetor CD44, ao mesmo tempo que atrasam a entrada destas micelas em, pelo menos, 30 minutos. Ao contrário do descrito na literatura, tanto as micelas funcionalizadas como as não funcionalizadas têm as mesmas proteínas a intervir na sua internalização. Ou seja, as micelas não funcionalizadas são internalizadas por um processo mediado por caveolae, enquanto nas funcionalizadas há um recrutamento de caveolae para a membrana. A P-gp pode estar localizada em muitos organelos celulares, como o retículo endoplasmático, o aparelho de Golgi e nos compartimentos endossomais. Quando as células estão em contacto com micelas vazias, a intensidade de fluorescência da P-gp não varia por comparação com o nível basal que esta proteína apresenta (controlo). Quando em contacto com micelas com fármaco encapsulado, verifica-se um aumento da intensidade da P-gp, que se encontra localizada predominantemente em vesículas endocíticas, numa resposta à libertação intracelular de salinomicina. Quando tratadas apenas com salinomicina, para além de um aumento da intensidade da P-gp, há também uma acumulação desta proteína em redor do núcleo. Tanto a salinomicina livre como a salinomicina encapsulada induzem um aumento da expressão de vimentina o que, de acordo com a literatura, pode significar que a salinomicina fosforila a proteína Akt, levando à consequente fosforilação da vimentina, bloqueando a apoptose. Desta forma, as células MDA-MB-231 utilizam a caveolina para internalizar estas micelas, sendo que a sua funcionalização induz um aumento da expressão do recetor CD44. Uma vez que na presença de micelas vazias não se verificou uma estimulação da atividade da P-gp, estas têm potencial para se tornarem bons nanotransportadores e permitir a acumulação intracelular de fármacos. No entanto a utilização de salinomicina poderá não ser uma boa terapia para erradicar estas células cancerígenas dado que induziu um aumento da expressão da vimentina.Mesenchymal-like adenocarcinomas are a subtype of triple-negative breast cancer (TNBC) adenocarcinomas that, as any TNBC, lack predictive biomarkers, such as estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR) and prognostic biomarkers, such as HER2. Thus, it presents a poor prognosis and aggressive clinical behavior. Since they can exhibit a stem-like phenotype, they are generally called cancer stem cells (CSCs) and overexpress some surface markers, such as CD44. CD44 is a transmembrane glycoprotein that has been linked to diverse intracellular mechanisms, from being a co-receptor for growth factors and cytokines uptake to sustain cell’ survival, proliferation and invasion. Besides overexpressing CD44, MDA-MB-231 breast cancer cells also express high levels of mesenchymal proteins, such as vimentin. Vimentin is responsible, among other things, for cell invasion and motility, and considered one marker of epithelial-to mesenchymal transition (EMT). Because they overexpress P-glycoprotein (P-gp), a membrane drug efflux pump, the cytotoxic drug is not accumulated in the cytoplasm but recycled to the outside of cells. Hence the necessity to develop new therapies that, besides targeting this subpopulation, can overcome the activity of P-gp. In the last few decades, nanomedicines are becoming the “holy grail” of cancer treatments because they are directly targeted to the cancer cells, based on the ERP (enhanced retention and permeabilization) effect, and by being functionalized against a specific surface marker deliver the cytotoxic drug to a specific type of cancer. Bearing in mind that nanoparticles preferably enter the cell via endocytosis, the main goal was to assess which type of endocytosis pathway is used in the uptake of functionalized and non-functionalized plain micelles in MDA-MB-231 breast cancer cells. Moreover, the aim of this work also comprised the determination of whether salinomycin would affect expression of vimentin and if the type of polymer used to make the micelles would mask salinomycin from the action of P-gp. Here we show that non-functionalized micelles are uptaken by a caveolae-mediated process and that uptake of functionalized micelles is done through a CD44-mediated endocytosis process. We also show that functionalization can delay the entry of these micelles by, at least, 30 minutes. Functionalized micelles not only recruit caveolin but also increase the expression of CD44 in the membrane surface, contributing to the idea that once CD44 receptor is activated, the cytoplasmic domain translocates to the nucleus and transcripts the CD44 gene. P-gp intracellular localization changes according to the treatment applied. In non-treated cells, it is mainly localized in the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus, while in the presence of micelles it is localized not only in those organelles, but also in endosomes, and its activity is constant after 30 minutes and 1 hour of incubation. When treated with free salinomycin, P-gp accumulation increases in the endoplasmic reticulum and plasma membrane as a response to drug accumulation. MDA-MB-231 breast cancer cells treated with free or loaded salinomycin show an increase in the expression of the mesenchymal protein vimentin. Thus, salinomycin may not be the best anticancer agent to kill breast cancer stem cells, but the micelles used in this work have a great potential to become a good transporter to have an intracellular accumulation of any cytotoxic drug. Either for functionalized and non-functionalized micelles, caveolin protein is the intervening player in the internalization of these micelles. In the presence of functionalized micelles, there is an increase in CD44 expression