Estudo do mecanismo de ação de novos compostos de ruténio com atividade antitumoral

Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017A quimioterapia é um tratamento tradicional do cancro. Sua alta toxicidade, afetando tecidos saudáveis, e a resistência intrínseca a fármacos são obstáculos que precisam de ser superados. Desta forma, a identificação de novos agentes quimioterapêuticos é fundamental para novos progressos no tratamento do cancro. Uma abordagem inclui complexos de ruténio, que foram reconhecidos como uma alternativa promissora e efetiva aos agentes de platina actualmente em uso clinico. O objetivo principal do presente trabalho consiste na avaliação do potencial antiproliferativo, bem como a identificação dos mecanismos de ação de complexos de ruténio(II) com co-ligandos da familia das tiosemicarbazonas de formulação [Ru(bpy)2(HL)][CF3SO3]2, em que bpy corresponde a 2,2-bipiridina e HL o co-ligando tiosemicarbazona. Em concreto, estudaram-se os complexos [Ru(bpy)2(HL1)][CF3SO3]2 (ACP19,) [Ru(bpy)2(HL2)][CF3SO3]2 (SA25), [Ru(bpy)2(HL3)][CF3SO3]2 ) (SA22), [Ru(bpy)2(HL4)][CF3SO3]2 (SA23), e os respetivos ligandos, HL1 (TSC-IndNCH3, , HL2 (TSC-Bztio), HL3 (TSC-OCH2) e HL4 (TSC-CH2OH). Os ensaios de viabilidade celular in vitro foram realizados nas linhas celulares tumorais, A2780 (linha celular do carcinoma do ovário), HCT116 (linha celular do carcinoma colorectal), A549 (linha celular do carcinoma do pulmão) e MCF-7 (linha celular do carcinoma da mama hormonodependente). Através destes resultados conclui-se que os ligandos não apresentavam citotoxicidade com a excepção do HL1. De entre os complexos avaliados, os complexos ACP19, SA25 e SA23 demonstraram ter a maior selectividade na linha tumoral A2780. Conclui-se que o complexo ACP19 e SA25 têm um maior efeito antiproliferativo e uma maior seletividade para a linha celular A2780 com valores IC50 de 0,5 e 0,6 μM, respetivamente. Por este motivo, estes complexos foram escolhidos para a caracterização do seu mecanismos de ação na linha celular A2780. Na presença dos complexos a linha celular tumoral A2780 exibe características de apoptose (fragmentação nuclear e condensação de cromatina) demonstradas pela coloração com Hoechst 33258. A análise por citometria de fluxo com marcação dupla com anexina V-FITC e Iodeto de propídio confirmou os resultados acima e revelou um grande número de células cancerígenas em apoptose inicial. Para confirmar o tipo de morte celular induzida pelos complexos, verificaram-se os níveis intracelulares das espécies reativas de oxigénio (ROS) e alterações no potencial da membrana mitocondrial. Os resultados demonstraram o envolvimento da via intrínseca da apoptose pela ocorrência da disrupção do potencial da membrana mitocondrial, embora não se tenha verificado qualquer contribuição de ROS na morte de células cancerígenas. A analise dos níveis de expressão das proteínas BAX e BCL-2 e a distribuição subcelular de ambos os complexos sugere que o principal alvo é a mitocôndria. Por outro lado, observou-se a morte celular autofágica induzida por ambos os complexos. O complexo ACP19 parece induzir um ligeiro atraso na progressão do ciclo celular na fase G2/M, ao contrário do complexo SA25 que não mostrou qualquer efeito em comparação com o controlo. Os estudos de interação com o DNA revelaram os complexos ACP19 e do SA25 interagem com os sulcos do DNA. Além disso, o ensaio de mobilidade eletroforética demonstra a incapacidade de os complexos desencadearem mudanças conformacionais no DNA plasmídico. Ensaios adicionais revelaram uma forte afinidade do complexo ACP19 com as proteínas albumina do soro humano e bovino. Os estudos relativos à proteómica permitiram confirmar a variação dos níveis de proteínas associada a processos de apoptose, de resposta stress e de atividade metabólica. Estes resultados indicam que os complexos estudados são agentes anticancerígenos promissores.Chemotherapy represents a traditional therapeutic approach for the cancer treatment. The high toxicity towards healthy tissues and the intrinsic drug resistance are obstacles that need to be overcome. The development and the identification of new chemotherapeutic agents is critical for further progress in cancer treatment. In this context ruthenium compounds have been recognized as a promising and an effective alternative to platinum drugs approved for clinical use. The main objective of the present project consists in the evaluation of the antiproliferative potential and the identification of mechanisms of action of the ruthenium complexes bearing a thiosemicarbazone co-ligand of formulation [Ru(bpy)2(HL)][CF3SO3]2) in which bpy is 2,2-bipyridine and HL thiosemicarbazone co-ligand. In particular, [Ru(bpy)2(HL1)][CF3SO3]2) (ACP19), [Ru(bpy)2(HL2)][CF3SO3]2 (SA25) [Ru(bpy)2(HL3)][CF3SO3]2 (SA22), [Ru(bpy)2(HL4)][CF3SO3]2 (SA23), and their ligands, HL1 (TSC-IndNCH3), HL2 (TSC-Bztio), HL3 (TSC-OCH2) e HL4 (TSC-CH2OH. The in vitro cell viability assays were performed in A2780 (ovarian carcinoma), HCT116 (colorectal carcinoma), A549 (lung carcinoma) and MCF-7 (brest carcinoma) cell lines. Results showed that the ligands didn’t exhibit cytotoxicity with the exception of HL1. Among the complexes evaluated, the complexes ACP19, SA25 and SA23 were shown to have the highest selectivity in A2780 cell line. Therefore, this assays showed that ACP19 and SA25 have a higher ciytotoxic effect and selectivity for the A2780 cell line with IC50 values of 0.5 and 0.6 μM, respectively. For this reason, these complexes were chosen for the evaluation of their mechanism of action. Ruthenium-treated A2780 cell line exhibited features of apoptosis (nuclear fragmentation and chromatin condensation) demonstrated by Hoechst 33258 staining. Flow cytometry using the double staining annexin V-FITC/Propidium Iodide confirmed these results and revealed a large number of cancer cells in an early stage of apoptosis. To confirm the mechanism of cell death induced by the complexes, the intracellular levels of species reactive of oxygen (ROS) and changes in mitochondrial membrane potential were verified. The obtained results demonstrated the involvement of the intrinsic pathway of apoptosis by the depletion of mitochondrial membrane potential, with no contribution of ROS in cancer cell death. In addition, the analysis of the expression levels of BAX and BCL-2 proteins and the subcellular distribution of both complexes suggest that the main target is mitochondria. In additional, autophagic cell death was observed in both complexes. Futher ACP19 was able to induce cell cycle delay in G2/M phase, unlike SA25 which didn’t induce any delay. DNA interaction studies showed that ACP19 and SA25 can interact with DNA through groove-binding. Moreover, the electrophoretic mobility assay revealed that these complexes do not compromise plasmid DNA conformation. Additionally, it was proved that ACP19 exhibited a significant binding to human and bovine serum albumin proteins. The expression levels of proteins associated with apoptosis, stress response and metabolic activity are altered by the action of these complexes, as assessed by proteomic studies. These results demonstrated that the complexes studied are promising anticancer agents