Pumonary and systemic endothelial function in diabetic animal models: effect of carotid sinus nerve denervation

Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017As doenças metabólicas afetam milhares de indivíduos em todo o mundo e representam um grupo de doenças crónicas de elevada prevalência. A diabetes mellitus tipo 2 (DMT2) é um dos maiores problemas mundiais que afetou, em 2015, aproximadamente 415 milhões de pessoas e acredita-se que a sua prevalência vai continuar a aumentar nos próximos anos. Esta patologia é uma condição metabólica crónica, caracterizada pela incapacidade de os tecidos periféricos usarem a insulina, produzida pelas células β, resultando numa condição designada de resistência à insulina, o que leva a hiperinsulinemia e consequentemente a hiperglicemia. Esta é a principal característica da DMT2 e é também um fator de risco para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares, como a hipertensão e aterosclerose, sendo fulcral na disfunção endotelial. As complicações vasculares da diabetes dividem-se em microvasculares e macrovasculares. O óxido nítrico (NO) é um potente vasodilatador e tem sido identificado pela sua participação na regulação do tónus vascular, fluxo sanguíneo e na modelação da libertação de mediadores do endotélio. O NO é produzido pelo NO endotelial juntamente com o cofator tetrahidrobiopterina, pela conversão da L-arginina em L-citrulina, nas células endoteliais, num processo regulado pelo stress, condições de oxigénio e inflamação. Foram identificadas três isoformas do NO sintase: NO neuronal sintase (nNOS), NO endotelial sintase (eNOS) e NO induzível sintase (iNOS). A hipertensão sistémica é um dos principais fatores de risco para as doenças cardiovasculares e contribui para uma elevada resistência vascular periférica. Demonstrou-se que em animais hipertensos a vasodilatação está reduzida e que essa diminuição pode estar relacionada com a redução da disponibilidade de óxido nítrico (NO). Também a hipertensão arterial pulmonar tem vindo a ser cada vez mais associada à DMT2 e à disfunção endotelial, e esta relação tem sido descrita como estando relacionada com o aumento da produção de superóxido, que por sua vez reage com o NO, reduzindo a sua difusão, o que leva a um aumento da vasoconstrição. A prostaglandina F2α (PGF2α) é um dos mais frequentes prostanoides estudados pela sua ação contráctil no musculo liso. O recetor FP é um recetor específico da PGF2α, que está associado a diferentes condições fisiopatológicas como a resistência à insulina, problemas cardiovasculares e diabetes. A disfunção endotelial é definida como um desequilíbrio entre a vasodilatação e a vasoconstrição do endotélio, por ação das substâncias produzidas neste. Uma das características usadas para detetar se há complicações na função endotelial, é investigar se a resposta fisiológica aos vasodilatadores está comprometida. Para tal é usualmente utlizada a resposta vasodilatadora à acetilcolina (ACh), que medeia a vasodilatação através do NO, produzido pelo endotélio. Na literatura, também é igualmente aceite que a disfunção endotelial está associada à diminuição da disponibilidade de NO. Esta diminuição pode ser causada pela redução na produção de NO pelo endotélio ou pelo aumento da sua inativação, pelas espécies reativas de oxigénio. O eNOS mantém várias funções homeostáticas nos vasos sanguíneos, como o relaxamento do endotélio, no entanto uma diminuição no eNOS pode levar ao desenvolvimento de resistência à insulina e problemas metabólicos, que são complicações que estão na génese de patologias, como a diabetes e hipertensão. Por outro lado, a expressão da iNOS é ativada por patologias de doenças inflamatórias, incluído a diabetes e a aterosclerose, sendo esta proteína identificada como essencial na resistência à insulina, na obesidade e nas disfunções contrácteis cardíacas e vasculares. O NO foi proposto como sendo um modulador inibitório do corpo carotídeo (CB). Os CBs são quimiorrecetores periféricos que detetam alterações no oxigénio, dióxido de carbono e níveis de pH no sangue arterial. Sabe-se que a sua atividade está aumentada em modelos de roedores com resistência à insulina e o nosso grupo mostrou anteriormente, que a resseção bilateral do nervo do seio carotídeo (CSN), previne por completo a resistência à insulina, hiperglicemia, dislipidemia e hipertensão arterial. Assim, dado que a disfunção endotelial pode resultar ou contribuir para o desenvolvimento de várias doenças como a hipertensão e DMT2 e sabendo que a hiperativação do CB está associada a estas doenças, o principal objetivo deste trabalho foi avaliar o impacto da resseção do CSN, na função endotelial da artéria pulmonar e no sistema vascular sistémico, como a artéria aorta. As experiências foram realizadas em ratos Wistar machos com 3 meses de idade. Estes animais foram submetidos a uma dieta hipercalórica (HFHSu) (60% de gordura) juntamente com 35% de sacarose na água durante 25 semanas. Este modelo é considerado uma fase inicial da DMT2, desenvolvendo assim resistência à insulina, intolerância à glucose e hipertensão. Estes animais foram comparados com um grupo controlo da mesma idade submetidos a uma dieta padrão. Após 14 semanas de dieta HFHSu, foi confirmada a resistência à insulina através dos testes de sensibilidade à insulina e de tolerância à glucose. Em seguida, os animais foram divididos aleatoriamente, em que metade foram submetidos a uma ressecção bilateral do CSN, e a outra metade submetidos ao mesmo procedimento cirúrgico, mas sem corte do CSN (grupo sham). Depois da cirurgia, os animais foram mantidos nas respetivas dietas e passado duas e onze semanas após a resseção do nervo, a sensibilidade à insulina e tolerância à glucose foram avaliadas. Passado este período, os animais foram submetidos a uma experiência terminal, onde os animais foram anestesiados com pentobarbital (60mg/kg, i.p.). O sangue foi recolhido por punção cardíaca para medir os níveis de NO por quimiluminescência. A artéria pulmonar e a aorta foram excisadas e dissecadas para estudos da função vascular, através de miografia, e para posterior homogeneização e análise da expressão, por Western Blot, e quantificação de NO. A sensibilidade à insulina foi avaliada pelo teste da tolerância à insulina (ITT), a tolerância à glucose pelo teste da tolerância à glucose oral e a pressão arterial foi registada através do transdutor e amplificador de pressão. Para além disso a função endotelial foi avaliada através da miografia, sendo as respostas contráteis com estímulo ao K+ e prostaglandina F2α (PGF2α) e as respostas vasodilatadoras induzidas pela ACh. Os níveis de NO no plasma, artéria pulmonar e aorta foram medidos através quimiluminescência e por fim a expressão das isoformas do NO sintase: eNOS e iNOS e do recetor da PGF2α (FP) foram analisados por Western Blot. Observou-se que a dieta HFHSu diminui a sensibilidade à insulina e aumentou a intolerância à glucose e a pressão arterial. A dieta hipercalórica aumentou os níveis de NO no plasma e as repostas contrácteis à PGF2α na aorta. Aumentou ainda os valores da expressão, tanto do iNOS, em ambas as artérias, como do recetor FP, na artéria pulmonar. No entanto, a dieta HFHSu, diminui a resposta contráctil à PGF2α na artéria pulmonar, o relaxamento à ACh em ambas as artérias e o nível de NO na aorta. Por outro lado, a resseção do CSN, restaurou para valores normais a sensibilidade à insulina, a tolerância à glucose e a pressão arterial. A resseção do CSN ainda normalizou os valores do NO no plasma e diminui as repostas ao K+ na artéria pulmonar e na aorta. Por fim, ainda restaurou por completo a vasodilatação dos animais HFHSu e normalizou os valores de expressão da iNOS, em ambas as artérias, e restabeleceu os níveis de expressão do recetor FP na artéria pulmonar. Os níveis de expressão do eNOS, em ambas as artérias, não sofreram nenhuma modificação nem pela dieta nem pela resseção do CSN. Neste estudo foi demonstrado pela primeira vez que a resseção do CSN nos animais HFHSu restaurou a função endotelial na artéria pulmonar e na aorta. Verificou-se também que a resseção do CSN nos animais HFHSu diminuiu os níveis de NO no plasma e que normalizou os valores da expressão do iNOS na artéria pulmonar e na aorta, bem como os valores da expressão do recetor FP na artéria pulmonar.Diabetes mellitus type 2 (DT2M) is a metabolic disease characterized by the inability of peripheral tissues to use insulin in the target organs, resulting in a condition known as insulin resistance, which leads to elevated levels of insulin and consequently glucose in blood. Systemic hypertension and arterial pulmonary hypertension have been associated, over the years, with DT2M and endothelial dysfunction, and it has been shown that hypertensive animals, exhibit a reduction in the vasodilation which in turn is related to a diminished nitric oxide (NO) levels, leading to a vasoconstriction in the vessels. Prostaglandin F2α (PGF2α) is a powerful vasoconstrictor which have been implicated in several pathological states. PGF2α cause vasoconstriction primarily through the FP receptor. There are numerous mechanisms that could cause endothelial dysfunction, but the most consensual is the decreased bioavailability of NO levels. NO is a vasodilator that helps to regulate the vascular tone and blood flow. It is produced by the endothelial NO with the cofactor tetrahydrobiopterin, through the conversion of L-arginine in L-citrulline. NO has been proposed to be an inhibitory modulator of the carotid body (CB) chemosensory process. The CBs are peripheral chemoreceptors that are known to be involved in several cardiometabolic pathologies, as essential hypertension, chronic heart failure and metabolic syndrome. It has been recently described that CBs activity is raised in models of insulin resistance and that carotid sinus nerve (CSN) resection can restore insulin resistance, hyperglycaemia, dyslipidaemia and arterial hypertension. Therefore, the main goal of this project was to evaluate the impact of CSN resection on the endothelial dysfunction in pulmonary artery and systemic vessels. Experiments were performed in 3 months old Wistar rats, fed with a high-fat and high-sucrose diet (HFHSu) during 25 weeks, or fed with a standard diet (CTL) during the same period. To evaluate the impact of CSN denervation, the animals were submitted to CSN resection at the fourteen weeks of diet. Insulin sensitivity, glucose tolerance, mean blood pressure, endothelial function in pulmonary artery and aorta, plasmatic NO levels and the expression of NO synthase isoforms in the pulmonary artery and aorta: endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) and also PGF2α receptor (FP) were evaluated in CTL and HFHSu animal models. Herein, HFHSu diet modify all the parameters above describe, except the contractile responses to K+ in both arteries, the NO levels in the pulmonary artery and the levels of expression of FP receptor on aorta. On the other hand, the CSN resection almost completely restored all the changes caused by the HFHSu diet-induced, apart from the NO levels in both arteries and the expression levels of FP receptor in the aorta. eNOS expression levels in both arteries were not modified nor by the diet neither by CSN resection. We demonstrated for the first time, that CSN resection restores completely endothelial function in the pulmonary artery and in the aorta. It was also shown that CSN resection decreased NO levels in plasma and normalized the levels the expression of iNOS, in both arteries, as well as the levels of expression of the FP receptor in the pulmonary artery