A role for miRNA-21 in non-alcoholic fatty liver disease pathogenesis

Tese de doutoramento, Farmácia (Biologia Celular e Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2017Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is characterized by an excessive accumulation of fat in the liver and encompasses a wide spectrum of hepatic lesions raging from simple steatosis to non-alcoholic steatohepatitis (NASH), further progressing to cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC), eventually culminating in liver failure and early death. NAFLD is intimately associated with obesity, diabetes and the metabolic syndrome. It is currently the most prevalent chronic liver disease worldwide, much due to its intricate pathogenic mechanisms and lack of successful pharmacological therapies. In the past few years, bile acids, nuclear receptors, including peroxisome proliferator-activated receptor α (PPARα) and farnesoid X receptor (FXR), and microRNAs (miRNAs/miRs) have emerged as promising therapeutic targets for liver diseases, particularly in the NAFLD context. The main goal of the work presented in this thesis was to dissect the role of miR-21 in NAFLD pathogenesis, thus contributing with new concepts and targets for the treatment of NAFLD. First, we explored the mechanisms by which deoxycholic acid (DCA), a toxic bile acid increased in the liver of NAFLD patients, modulates the miR-21 pathway. Our results showed that DCA decreases the expression of miR-21 both in vitro and in vivo, leading to a consequent increase in protein levels of its direct target programmed cell death 4 (PDCD4) and, subsequently, apoptosis. Importantly, DCA-dependent modulation of the miR-21/PDCD4 pathway occurs through nuclear factor kB (NF-kB) transcriptional inhibition, likely due to increased oxidative stress and consequent p53- induced protein with a death domain (PIDD) proteolysis and caspase-2 activation. In diet-induced animal models of NASH, liver miR-21 expression was increased, concomitantly with decreased expression of PPARa, a miR-21 direct target. In turn, miR-21 KO mice fed a NASH-inducing diet displayed decreased steatosis, lipoapoptosis, liver injury, inflammation and were protected against fibrosis development. Moreover, in a complementary animal model of NAFLD, with features of the metabolic syndrome, miR-21 ablation and FXR activation, through the use obeticholic acid (OCA), further impacted on NASH development, reducing lipid and cholesterol accumulation, decreasing inflammation markers and oxidative stress and restoring lipid metabolism and insulin sensitivity in the liver and muscle. Importantly, the miR-21 pathway was also found deregulated in the liver, muscle and serum of NAFLD patients, with miR-21 expression increasing from simple steatosis to NASH. Finally, the miR-21/PPARa axis was progressively increased in NASH-associated HCC, in parallel with reduced FXR mRNA and protein expression and disturbed mitochondrial dynamics. Overall, our results suggest that, during steatosis, increased DCA levels inhibit miR-21, inducing hepatocyte cell death and sensitizing the steatotic liver to additional NASH-inducing stimuli. As disease progresses and cell death and inflammation settle, miR-21 levels significantly increase, aggravating NASH and, eventually, promoting HCC. Importantly, miR-21 ablation in combination with FXR activation strongly impaired NASH development and should be regarded as a prospective therapeutic option for NAFLD patients.A doença hepática crónica é um dos maiores problemas de saúde da atualidade. Nos últimos anos, a percentagem de doentes com esta patologia atingiu um número alarmante, em paralelo com a percentagem de mortes associadas à doença. Em particular, com o aumento endémico da obesidade, da diabetes e da síndrome metabólico, a prevalência e incidência do fígado gordo não alcoólico (FGNA) está a atingir níveis alarmantes em todo o mundo. O FGNA engloba um espectro de lesões hepáticas que vão desde a esteatose até à esteatohepatite não-alcoólica (EHNA), cirrose e carcinoma hepatocelular, culminando em falha hepática e morte. A patogénese do FGNA apresenta um grau de complexidade elevado, não sendo ainda totalmente conhecidos os mecanismos exatos responsáveis pela sua iniciação e progressão. Ainda assim, a acumulação excessiva de gordura parece representar o fator primário que despoleta a doença, ao provocar alterações no metabolismo dos ácidos gordos. Consequentemente, acumulam-se metabolitos tóxicos no fígado, que induzem stress oxidativo, resistência à insulina e morte celular, favorecendo assim a progressão da doença. Mais ainda, o aparecimento de fibrose e a progressão para cirrose aumentam a predisposição para o desenvolvimento de carcinoma hepatocelular, contribuindo para uma probabilidade aumentada de falência hepática. Deste modo, e devido à inexistência de terapias farmacológicas, o FGNA está rapidamente a tornar-se a maior causa de transplante hepático nos países desenvolvidos. De facto, as abordagens terapêuticas de primeira linha incluem alterações no estilo de vida, tais como mudanças nos hábitos alimentares e aumento da atividade física, mas que muitas vezes acabam por se revelar ineficazes, pela falta de aderência dos doentes. Os ácidos biliares, os recetores nucleares e os microRNAs (miRNAs ou miRs) têm sido implicados na patogénese do FGNA. Os miRNAs são pequenos RNAs endógenos não codificantes, com aproximadamente 22 nucleótidos. Atuam como reguladores negativos da tradução proteica, ligando-se a um RNA mensageiro (mRNA) alvo especifico. A formação de um complexo contendo o miRNA e o mRNA correspondente resulta na inibição da tradução, quer por desadenilação do mRNA, com consequente degradação, quer por inibição direta da tradução. Deste modo, os miRNAs regulam várias vias de sinalização celular, modulando a apoptose, proliferação e sobrevivência celulares, assim como o metabolismo da glucose e dos lípidos. Por sua vez, os miRNAs podem ser diferencialmente modulados por ácidos biliares. Finalmente, os recetores nucleares são fatores de transcrição ativados por ligandos, regulando vários processos metabólicos. Em particular, o recetor α ativado pelo proliferador do peroxisoma (PPARα) e o recetor X do farnesóide (FXR) têm sido os mais estudados no âmbito do FGNA. O objetivo principal desta tese foi identificar e explorar o papel do miR-21 na patogénese do FGNA, procurando encontrar novos alvos terapêuticos potenciais para o tratamento desta patologia. Em primeiro lugar, tendo em conta que mostrámos previamente que o ácido desoxicólico (DCA) está aumentado no fígado de doentes com FGNA e que inibe a expressão do miR-21, em hepatócitos primários de rato, começou-se por explorar quais os mecanismos responsáveis por esta modulação. Os resultados evidenciam que concentrações de DCA entre 50-200 μM inibem a expressão do miR-21 in vitro, de um modo dependente da dose, aumentando a expressão do seu alvo direto programmed cell death 4 (PDCD4) e contribuindo para um aumento de atividade das caspases-3 e -7, culminando em morte celular. Tanto a sobre-expressão do miR-21 como o silenciamento da PDCD4 reduziram significativamente a apoptose induzida pelo DCA. Em seguida, sabendo que o fator nuclear kB (NF-kB) foi já descrito como um regulador transcricional do miR-21, prosseguimos com a avaliação da sua expressão e ativação após incubação com doses crescentes de DCA. Os resultados mostraram que o DCA modula a atividade do NF-kB, com um padrão semelhante à modulação do miR-21. Para além disso, estudos funcionais utilizando ativadores e/ou inibidores genéticos e farmacológicos da via do NF-kB mostraram que a modulação da via do miR-21/PDCD4 pelo DCA é dependente da atividade transcricional do NF-kB. Mais ainda, a incubação de hepatócitos primários de rato com doses crescentes de DCA induziu um aumento significativo nos níveis de espécies reativas do oxigénio, conduzindo a uma ativação da proteólise da proteína com um domínio de morte induzida pelo p53 (PIDD), e favorecendo a formação do fragmento PIDD-CC que ativa a caspase-2. O uso de um composto com capacidades antioxidantes, a Nacetilcisteína, preveniu a morte induzida pelo DCA e a inibição da via miR-21/PDCD4. Por fim, a administração de DCA por gavagem oral a ratos durante 1 e 3 dias teve efeitos semelhantes aos resultados obtidos in vitro, corroborando a importância deste ácido biliar na promoção da morte celular no fígado, pelo menos em parte, por modular a via miR-21/PDCD4. Em seguida, avaliou-se a expressão e função do miR-21 durante a patogénese e progressão do FGNA, usando murganhos knockout (KO) para o miR-21 alimentados com dietas indutoras de EHNA. Em comparação com os animais controlo, que desenvolveram múltiplos aspetos da EHNA, incluindo esteatose macrovesicular, agregados inflamatórios e fibrose, os animais KO para o miR-21 apresentaram uma redução significativa de esteatose, inflamação, lipoapoptose e dano hepático, sendo ainda resistentes ao desenvolvimento de fibrose. Na ausência do miR 21, estes animais apresentaram ainda níveis hepáticos de PPARa superiores aos animais controlo. Num segundo modelo experimental de EHNA utilizando uma dieta fast food (FF), recapitulando características metabólicas da patologia nos humanos, avaliámos o potencial efeito terapêutico da ativação simultânea de dois recetores nucleares no desenvolvimento da EHNA: a ativação da PPARa, observada em animais KO para o miR-21 e a ativação do FXR, através da administração do ácido obeticólico (OCA) na dieta. Foi notório que a ausência do miR-21 em combinação com o OCA preveniu a obesidade e a hepatomegália induzidas pela dieta FF, em paralelo com uma redução acentuada na esteatose e no conteúdo hepático de colesterol. Mais ainda, o aumento de stress oxidativo e as perturbações no metabolismo lipídico induzidas pela dieta FF, incluindo um aumento no aporte hepático de ácidos gordos e uma redução na boxidação lipídica, foram completamente normalizados aquando da ativação simultânea de ambos os recetores nucleares. Da mesma forma, o aumento de infiltrados inflamatórios e citocinas pro-inflamatórias no fígado dos animais controlo alimentados com a dieta FF estava significativamente reduzido nos animais KO para o miR-21, alimentados com a dieta FF suplementada com o OCA. É importante referir que a expressão do miR-21 se encontrava também aumentada no músculo dos animais controlo alimentados com a dieta FF e que esta nova abordagem terapêutica restabeleceu a via de sinalização da insulina, não só no fígado, mas também no músculo destes animais. Por fim, a expressão do miR-21 estava elevada no fígado, músculo e soro de doentes com FGNA, aumentando da esteatose simples para a EHNA, corroborando o papel chave deste miRNA no desenvolvimento da doença. Por fim, alimentámos murganhos com uma dieta deficiente em colina e com composição definida em aminoácidos (dieta CDAA) durante 66 semanas, com o intuito de induzir EHNA e carcinoma hepatocelular. Verificámos que todos os animais desenvolveram EHNA, fibrose e nódulos pré-neoplásicos. Estes animais apresentavam também uma redução na via de sinalização da insulina, em paralelo com um aumento de stress oxidativo e de fissão mitocondrial. Mais ainda, a expressão do miR-21 encontrava-se significativamente aumentada no fígado, concomitantemente com uma redução na expressão do seu alvo PPARa. Também o recetor nuclear FXR estava reduzido no fígado de animais com EHNA e/ou com nódulos neoplásicos, corroborando a importância destas proteínas na patogénese da doença. Os resultados apresentados nesta tese sugerem que, na esteatose simples, os elevados níveis de DCA inibem a expressão do miR-21, induzindo morte celular e sensibilizando o fígado esteatótico na progressão da doença para EHNA. Subsequentemente, após um estabelecimento definitivo de um estadio inflamatório e de elevada morte celular, os níveis de expressão do miR-21 aumentam significativamente, agravando a doença e promovendo, eventualmente, o desenvolvimento de carcinoma hepatocelular. De salientar que a ausência do miR-21 em combinação com a ativação do FXR melhorou circunstancialmente o EHNA em ratinhos e poderá ser, no futuro, considerada como uma abordagem terapêutica promissora para doentes com FGNA