Akt2 siRNA-nanoparticulate system as a new tool to restoration of e-cadherin and eradicate tumor metastic phenotype

Tese de doutoramento, Farmácia (Tecnologia Farmacêutica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2017Cancer has currently a major impact in the worldwide health, with breast and colon carcinomas presenting the second and third highest incidence rates, respectively. Despite the important advances in understanding the mechanism of carcinogenesis, disease progression, and development of new and more effective therapies, advanced cancer is still generally an incurable disease. The currently used treatments have improved both the survival and cure rates of patients; however there are some serious drawbacks, mostly concerning high toxicity and serious side-effects, which may cause even the death of a small percentage of patients. Furthermore, many patients suffer from tumors that are resistant to the conventional treatments, thus not taking profit from any therapeutic benefit. The resistance seen in the aggressive forms of the disease remains to be the biggest challenge of current treatments. More than half of the treated patients suffer from a disease relapse, most of them with distant metastases. Cancer maintenance, resistance to therapy, and metastatic disease seem to be sustained by the presence of cancer stem cells (CSC) within the tumors. These cells retain the capacity of repopulating the tumor after the treatment, while being insensitive to conventional anticancer therapies, antimitotic agents or radiation. It is still not entirely clear if CSC originate from the epithelial stem cells which are essential to maintain proliferative homeostasis or result by accumulation of mutations from differentiated cells. However it is known that only a few number of CSC are necessary and sufficient for tumor regeneration. In this scenario, new cancer therapies under development should fulfil two conditions: (i) reduce the toxicity displayed in current therapies and most importantly, (ii) specifically target and eliminate CSC to overcome drug resistance and tumor recurrence. Both criteria could be accomplished using innovative targeted nanomedicines for drug and/or gene delivery, which is widely expected to bring promise and create novel therapeutics in advanced cancer therapy. Nanoparticles have shown, in both preclinical and clinical practice, to improve the therapeutic window of the therapeutic agents by specifically delivering higher concentrations to the tumor lesions, while reducing the systemic toxicity. This behavior explains the increased interest of research groups and pharmaceutical companies in nanomedicine-based systems to treat cancer, resulting in an increase in the approved and clinically tested products in the last decades. The advances observed in molecular biology and biotechnology have been contributing for the identification and understanding of the complex biological pathways associated with cancer development, and consequently for the emergence of gene therapy as a promising AKT2 siRNA-Nanoparticulate System as a New Tool To Restoration of E-Cadherin and Eradicate Tumor Metastic Phenotype therapeutic alternative in diseases with a strong genetic component. New biomarkers and therapeutic targets have been identified. AKT2 is one of the three Protein (serine/threonine) Kinase B (PKB or AKT) isoforms that is amplified in solid tumors. This oncogene is increased in response to apoptosis and its activation is also associated with phosphoinositide 3-kinase (PI3K) related effects as well as TWIST-promoted metastatic process by enhancing cell migration and invasion. Activation of TWIST/AKT2 signaling pathway is involved in E-cadherin silencing in the population of CSC, conferring them high tumorigenic potential. Thus, a therapeutic RNAi-mediated strategy using AKT2 as a downstream target represents an enormous step forward CSC eradication and anti-cancer therapy. The effects of AKT2 silencing in different breast and colon cancer cells, expressing and non-expressing TWIST are discussed in the present work. The obtained results demonstrated that the AKT2 inhibition is effective in terms of reducing cells migration, invasion, and transformation via different mechanisms and do not depend on the presence of TWIST within the tumor. We were able to observe that for cell lines expressing TWIST, AKT2 acts via Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT) reversion, while for cells not expressing TWIST, AKT2 acts via mTOR pathway promoting the reduction of stemness markers and alteration in the expression of apoptotic genes such as the Bcl-2 and p53. In summary, the aim of this work was to silence the AKT2 expression using an small interfering RNA (siRNA) against the AKT2 (siAKT2) in different cancer cells lines in order to prove that, not only in bulk cancer cells but also in the sub-population of CSC, the AKT2 knockdown is able to impair their increased tumorigenic ability, reverting their mesenchymal phenotype, reducing cell invasion, inhibiting colony formation or inducing apoptosis. Due to the effect of AKT2 in both bulk cells and CSC, the therapy with siAKT2 could be used as two different strategies: i) to revert the EMT and maintain the tumors in its primary stage for easier chirurgical removal, and ii) prevent the tumor recurrence through the inhibition of CSC tumorigenic and metastatic potential. Despite the enormous outbreak of gene therapy in the last years, its clinical use is still limited mainly due to genetic material-associated delivery difficulties, such as fast degradation, insufficient transfection efficiency or dose limiting vectors toxicity. In order to overcome these problems, we pursued the development and validation of a nanocarrier composed by Pluronic® F127 micelles associated with polyethylenimine (PEI)-based polyplexes to deliver a siAKT2. The proposed system for the delivery of siAKT2 seems to gather the requirements for an efficient and safe transport of siRNA in terms of their physicochemical characteristics, internalization capacity, biological efficacy and toxicity profile. These results make us believe that this new formulation will constitute a technological platform for the development of systems to encapsulate different siRNAs, as well as other types of genetic material. We are putting efforts in the improvement of these formulation in order to achieve a potential gene or multifunctional delivery system, approaching the so increasingly required personalized and combined therapies and bringing new hope into the field of cancer therapy.As doenças oncológicas possuem um enorme impacto na saúde das populações a nível mundial, apresentando o cancro da mama e o do cólon a segunda e terceira maior taxa de incidência, respetivamente. Apesar dos importantes avanços observados nos últimos anos na compreensão dos mecanismos de carcinogénese e progressão da doença, bem como no desenvolvimento de terapias mais eficazes, o cancro em estadios mais avançados é ainda geralmente uma doença incurável. Os tratamentos usados atualmente têm vindo a melhorar as taxas de sobrevivência e de cura dos doentes, contudo existem ainda algumas dificuldades especialmente relativas à elevada toxicidade e aos efeitos secundários severos, responsáveis até pela morte de uma pequena percentagem dos doentes. Adicionalmente, muitos doentes apresentam tumores que são resistentes aos tratamentos convencionais, não alcançando assim nenhum benefício terapêutico. A resistência à terapêutica observada nas formas mais agressivas da doença continua a ser o maior desafio dos tratamentos atuais. Mais de metade dos doentes tratados com terapias convencionais sofrem de uma recidiva da doença, na sua maioria com metástases distantes. A manutenção do cancro, a resistência à terapia e o potencial metastático da doença parece ser sustentado pela presença de células estaminais cancerígenas (CEC) no microambiente do tumor. Estas células retêm a capacidade de repopular o tumor após o tratamento e são insensíveis aos tratamentos convencionais com compostos antimitóticos ou à radiação. Ainda não está absolutamente esclarecido se as CEC são originadas a partir das células estaminais epiteliais, essenciais à manutenção da proliferação homeostática, ou se resultam da acumulação de mutações de células diferenciadas. No entanto, estudos demonstram que apenas um pequeno número de CEC é suficiente para provocar a regeneração do tumor. Perante este cenário, as novas terapêuticas para o cancro em desenvolvimento devem satisfazer duas condições: 1) reduzir a toxicidade causada pelas terapias atuais e, mais importante ainda, 2) atingir e eliminar especificamente as CEC de forma a evitar a resistência à terapêutica e a recorrência do tumor. Ambas as condições podem ser alcançadas usando terapêuticas inovadoras baseadas em nanomedicina direcionada para a veiculação de fármacos e/ou material genético, nas quais se deposita uma nova esperança no campo da terapia contra o cancro avançado. As nanopartículas têm demonstrado, tanto na prática clínica como na pré-clínica, serem capazes de melhorar a janela terapêutica de um determinado fármaco ao permitir a entrega de maiores AKT2 siRNA-Nanoparticulate System as a New Tool To Restoration of E-Cadherin and Eradicate Tumor Metastic Phenotype concentrações do mesmo às lesões tumorais, reduzindo ao mesmo tempo a sua toxicidade sistémica. Este comportamento explica o interesse crescente que se tem verificado por parte de diversos grupos de investigação e indústrias farmacêuticas na nanomedicina para o tratamento do cancro. Consequentemente, nos últimos anos, tem-se verificado também um aumento na aprovação e entrada no mercado, bem como a aplicação clínica de produtos baseados em nanopartículas. Os avanços na biologia molecular e biotecnologia têm contribuído para a identificação e compreensão das complexas vias biológicas associadas ao desenvolvimento do cancro e, consequentemente têm contribuído para o crescimento da terapia génica como uma alternativa terapêutica promissora para o tratamento de doenças com um forte componente genético. Novos biomarcadores e agentes terapêuticos têm sido identificados nos últimos anos. O AKT2 é uma das três isoformas da proteína quinase B (PKB ou AKT) que está amplificada em tumores sólidos. Este oncogene está aumentado em resposta à apoptose e a sua ativação está também associada com os efeitos da fosfoinositídeo 3-quinase (PI3K) e com o processo metastático promovido pelo TWIST, nomeadamente o aumento da migração e invasão celular. A activação da via biológica TWIST/AKT2 está envolvida no silenciamento da E-caderina na população de CEC, o que lhes confere um elevado potencial tumorogénico. Desta forma, uma estratégia terapêutica baseada na tecnologia de RNA de interferência, usando a AKT2 como alvo, surge como uma alternativa importante na terapia oncológica e, mais importante, na erradicação das CEC. Os efeitos do silenciamento do AKT2 em diferentes linhas celulares de cancro da mama e do cólon, com e sem expressão de TWIST, são discutidos no presente trabalho. Os resultados obtidos demonstram que a inibição do AKT2 é eficaz na redução da migração, invasão e transformação celular via diferentes mecanismos e que não depende da presença de TWIST no tumor. Foi possível observar que para as linhas celulares que expressam TWIST, o AKT2 atua via redução da transição epitelial-mesenquimal (EMT), enquanto que em células que não expressam TWIST, o AKT2 atua pela via do mTOR promovendo a redução de marcadores de malignidade e alteração de genes apoptóticos como o Bcl-2 e o p53. Em resumo, o objetivo deste trabalho consiste no silenciamento da expressão do AKT2 usando pequenos fragmentos de RNA de interferência (siRNA) contra o AKT2 (siAKT2) com o objetivo de provar que, não apenas em linhas de cancro parentais mas também nas sub-populações de CEC, o silenciamento do AKT2 é capaz de comprometer as suas características tumorigénicas através da reversão do seu fenótipo mesenquimal, redução da invasão celular, inibição da formação de colónias ou indução da apoptose. Devido ao efeito observado do AKT2 nas células de cancro parentais e também nas CEC, a terapia com siAKT2 poderia ser usada em duas possíveis estratégias: 1) para reverter o EMT e manter os tumores no seu estadio inicial, e como tal mais facilmente removíveis cirurgicamente, e ii) prevenir a recorrência do tumor através da inibição do potencial tumorigénico e metastático das CEC. Apesar da enorme eclosão da terapia génica nos últimos anos, o seu uso clínico é ainda bastante limitado, maioritariamente devido às dificuldades relacionadas com a veiculação do material genético tais como a rápida degradação dos oligonucleótidos, a insuficiente eficiência de transfeção ou a toxicidade associada aos vetores usualmente utilizados. Com o objetivo de ultrapassar esses problemas, este trabalho teve como segundo objetivo o desenvolvimento e validação de uma formulação para a veiculação de siAKT2, consistindo em micelas de Pluronic® F127 associadas com poliplexos de polietilenoimina (PEI). O nanosistema proposto parece preencher os requisitos necessários a um transportador de siRNA seguro e eficiente em termos das suas características físico-químicas, capacidade de sofrer internalização pelas células, eficácia biológica, e perfil de toxicidade. Estes resultados promissores fazem-nos acreditar que esta nova formulação pode servir como uma plataforma tecnológica ao desenvolvimento de sistemas para encapsular diferentes siRNAs, bem como outros tipos de material genético. Reunimos esforços no sentido de melhorar esta formulação com o objetivo de alcançar um sistema de veiculação genético e/ou multifuncional promissor. Desta forma, será possível alcançar mais facilmente a desejada terapia combinada e personalizada e com o objetivo final de trazer uma nova esperança no campo da terapia contra o cancro.Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN 2007-2013), Programa Operacional Potencial Humano (POPH