Molecular insights into the role of alfa-synuclein phosphorylation in synucleinopathies

Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2016As doenças neurodegenerativas, tal como a Doença de Parkinson (DP) e a Doença de Alzheimer resultam da perda progressiva de populações neuronais específicas levando ao aparecimento de sintomas clínicos característicos de cada doença. Estas pertencem a uma vasta superfamília de patologias conhecidas como sendo doenças onde existe a perda da conformação correta de proteínas, resultante da aquisição de uma conformação aberrante por parte de proteínas específicas, o que as torna mais propensas a agregar e formar estruturas em folha-beta como a estrutura amiloide. A composição dos agregados, assim como a sua localização em células, tecidos e órgãos, é específica de cada doença. A DP é a segunda doença neuronal degenerativa mais comum. A perda progressiva de neurónios dopaminérgicos na substantia nigra pars compacta (SNpc) e a acumulação de Corpos de Lewy (CL) são os marcadores patológicos nesta doença. A alfa-sinucleína (aSyn) é o maior componente dos CLs e é uma proteína chave em outras doenças neurodegenerativas comumente conhecidas como sinucleinopatias, tal como a demência com Corpos de Lewy e a Atrofia de Múltiplos Sistemas (AMS). Embora multiplicações e mutações no gene que codifica a aSyn terem sido associadas a formas familiares da DP, a maioria dos casos são esporádicos. O mecanismo preciso envolvido na perda de conformação e agregação da aSyn permanece por elucidar. Por exemplo, é também incerto se as inclusões proteicas atuam como espécies protetoras ou tóxicas na patogénese da DP. Portanto, investigar as vias moleculares envolvidas na agregação proteica é essencial para a compreensão da progressão da doença e pesquisa de novos alvos terapêuticos para a DP e para as outras doenças relacionadas. A fosforilação é uma modificação pós-tradução (MPT) importante para a sinalização celular, e está envolvida na agregação e toxicidade de proteínas em várias doenças neurodegenerativas. O estudo da fosforilação na aSyn é um tópico importante de investigação, dado que aproximadamente 90% da aSyn depositada em CL é fosforilada na serina 129 (S129), enquanto que menos de 4% da aSyn é fosforilada na proteína solúvel. No entanto, ainda não está elucidado se esta ou outras MPT na aSyn poderão ter um papel na doença, ou como poderão influenciar a agregação e a toxicidade da proteína. A fosforilação da aSyn tem sido abordada em diferentes aspetos, como a pesquisa de cinases e fosfatases capazes de modular esta MPT. Dadas as associações entre fosforilação e agregação, a modulação desta MPT elevou-se como uma estratégia terapêutica atrativa. A contribuição da fosforilação na aSyn neste e em outros resíduos na agregação e toxicidade continua elusiva apesar do grande esforço para desvendar o seu envolvimento no processo de doença. Avanços nesta área poderão fornecer novos alvos terapêuticos para o tratamento de sinucleinopatias. Esta dissertação focou-se na identificação de novas cinases e fosfatases envolvidas na patobiologia da aSyn usando um modelo bem estabelecido para a DP: a levedura Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). S. cerevisiae é um organismo eucariota simples e muito bem caracterizado, tanto a nível celular como ao nível genético. Além disso, este modelo tem sido capaz de fornecer conhecimentos sobre os mecanismos moleculares fundamentais da aSyn e de recapitular várias características importantes, como a formação de acumulações citoplasmáticas similares às inclusões da aSyn humana e alteração no tráfego vesicular. Apesar de a levedura carecer de ortólogos óbvios para alguns dos genes associados a DP, como a aSyn, tem sido utilizada extensivamente como modelo para o estudo da aSyn. Além disso, a descoberta de que a aSyn faz parte de uma diversa rede de interações incluindo cinases e fosfatases foi identificada em grandes estudos genéticos feitos em levedura e que foram posteriormente confirmados em células de mamífero. Em levedura, a aSyn é submetida a várias MPT observadas em células de mamífero e em cérebros de pacientes com DP, nomeadamente a fosforilação na S129. Apesar da relevância da fosforilação da aSyn na S129, tem sido exposta a importância de explorar as interações entre as diferentes MPT. Portanto, neste trabalho investigou-se o papel de um grupo de cinases e fosfatases na fosforilação da aSyn, formação de inclusões e toxicidade através da sua co-expressão com a aSyn humana. Demonstrou-se que não existe uma correlação estrita entre a percentagem de células que formam inclusões de aSyn e a toxicidade. Cdc28, uma cinase envolvida no ciclo celular, foi capaz de reduzir a fosforilação da aSyn na S129 de uma forma dependente do tempo. Os resultados revelaram ainda que os papéis desempenhados pelas cinases e fosfatases na toxicidade da aSyn estarão relacionados, pelo menos em parte, com outras funções desempenhadas por estas proteínas na célula, e não com uma alteração direta dos níveis de fosforilação na aSyn. A função da aSyn ainda não está totalmente clarificada devido à sua aparente participação em diversos processos celulares. No entanto, observações concordantes sugerem um papel como regulador da reciclagem vesicular na sinapse. Em células de levedura, o tráfego vesicular entre o retículo endoplasmático (RE) e o Complexo de Golgi (Golgi) foi observado como um defeito inicial após a expressão da aSyn. Um potencial avanço na compreensão da toxicidade da aSyn na PD resultou da realização de grandes estudos genéticos através da sobre-expressão de genes em busca de supressores da toxicidade da aSyn em levedura, proporcionando uma oportunidade para a procura de genes cuja sobre-expressão em conjunto com a aSyn restabeleceria a viabilidade celular. Estudos posteriores demonstraram que a toxicidade originada pela expressão da aSyn poderia ser suprimida pela sobre-expressão de proteínas envolvidas na maquinaria de transporte entre o RE e o Golgi. Desde a validação da levedura como modelo celular para o estudo da patobiologia da aSyn, os seus recursos genéticos permitiram a realização de grandes estudos, nos quais foram identificados modificadores da toxicidade gerada pela expressão da aSyn. Estes conhecimentos impulsionaram o estudo do papel da Sly41 na formação de inclusões e toxicidade da aSyn, e uma possível interação entre as proteínas. Estudos anteriores demonstraram que a expressão em multicópia do gene SLY41 suprimiu a perda do gene YPTI, que codifica uma Rab GTPase requerida para o transporte entre o RE e o Golgi. A sobre-expressão da Sly41 na via secretória eleva os níveis de cálcio no citosol para suprimir os defeitos na formação de vesículas. Diversas evidências indicam que o cálcio desempenha um papel na regulação do tráfego membranar através da via secretória. Além disso, a Sly41 foi identificada como sendo eficientemente adicionada a vesículas COPII para o seu tráfego entre o RE e o Golgi, e a sua correta localização nas membranas do RE e Golgi é requerida para a sua função como supressor. Observou-se neste trabalho que a sobre-expressão da aSyn com a Sly41 em células de levedura levou a um aumento da percentagem de células com inclusões de aSyn, com a particularidade de estas apresentarem uma única inclusão, um fenótipo que é diferente da expressão isolada da aSyn. Curiosamente, a sobre-expressão da SLY41 per si é muito tóxica e a sua deleção aparenta ser protetora com a expressão da aSyn, sugerindo um potencial efeito tóxico da sobre-expressão da Sly41 relacionado com a sua função na regulação dos níveis intracelulares de cálcio. A construção do gene SLY41 com um marcador fluorescente permitiu o estudo da co-localização entre a Sly41 e a aSyn, sugerindo que a forma citotóxica da aSyn em levedura pode associar-se com vesículas de transporte tal como a aSyn normalmente se associa com as vesículas sinápticas, e que foi anteriormente descrito para a Ypt1. No geral, a regulação da homeostasia intracelular do cálcio é complexa e permanece pouco compreendida, e a análise do seu possível papel na agregação da aSyn deve fornecer conhecimentos relevantes para a patobiologia da DP. Claramente, os desafios para o futuro irão continuar na pesquisa do efeito da toxicidade originada pela aSyn e o entendimento de como esta proteína patológica se torna fosforilada e a medida a que as MPT têm impacto na agregação da proteína. Estes esclarecimentos poderão fornecer conhecimentos chave para a etilogia da DP. Notavelmente, o nosso estudo identificou modificadores adicionais da agregação e toxicidade da aSyn envolvidos numa variedade de funções celulares, sugerindo uma variedade de novas proteínas capazes de modular a patobiologia da aSyn.Neurodegenerative disorders, such as Parkinson’s disease (PD) and Alzheimer’s disease result from the progressive loss of specific neuronal populations, leading to the appearance of the clinical symptoms that are distinctive of each disorder. They belong to a wide superfamily of pathologies known as protein misfolding disorders, resultant from the aberrant folding of particular proteins, which makes these proteins more prone to aggregate and form amyloid-like beta-sheet structures. The composition of the aggregates, as well as their localization in cells, tissues and organs, is specific of each disease. PD is the second most common neuronal degenerative disorder. The progressive loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta (SNpc) and the accumulation of Lewy bodies (LBs) are the pathological hallmarks in this disorder. aSyn is the main component of the LBs and one key protein in other neurodegenerative diseases commonly known as synucleinophathies, such as dementia with LBs and Multiple Systems Atrophy (MSA). Although multiplications and missense mutations in the gene encoding for aSyn have been associated with familial forms of PD, the majority of cases are sporadic. The precise mechanisms involved in aSyn misfolding and aggregation remain unclear. For example, it is also uncertain whether LBs are protective or toxic species in the PD pathogenesis. Therefore, defining the molecular pathways involved in protein aggregation is essential for understanding the disease progression and for defining new targets for intervention in PD and related diseases. Phosphorylation is a key posttranslational modification (PTM) for cellular signaling, and is involved in protein aggregation and toxicity in several neurodegenerative disorders. The study of aSyn phosphorylation is an important topic of research, given that approximately 90% of aSyn in LBs is estimated to be phosphorylated at serine 129 (S129), whereas less than 4% of aSyn is phosphorylated in the soluble protein. However, it is still not clear whether this and other PTMs in aSyn play a role in the disease, or how they can influence the aggregation and toxicity of the protein. The phosphorylation of aSyn has been addressed from different angles, such as the search of kinases and phosphatases able to modulate this PTM. Given the associations between phosphorylation and aggregation, modulation of this PTM increased as an attractive therapeutic strategy. The contribution of aSyn phosphorylation on this and in other residues in aggregation and toxicity remains elusive despite the great effort to discover its involvement towards the disease process. Advances in this area may provide new therapeutic targets to treat synucleinopathies. This dissertation focused on the identification of novel kinases and phosphatases involved in the pathobiology of aSyn using one well-established model for PD: the yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). S. cerevisiae is a simple and very well characterized eukaryotic organism, both at genetic and cellular levels. Moreover, this model has been able to provide insights into the fundamental molecular mechanisms of aSyn and recapitulate several important features, such as the formation of cytoplasmic accumulations similar to human aSyn inclusions and alterations of vesicular trafficking. Even though yeast lacks obvious orthologs for some PD-associated genes, as aSyn itself, it has been extensively used as a model to study aSyn. Furthermore, the finding that aSyn is part of a diverse interaction network including kinases and phosphatases was identified in genetic screens performed in yeast and was further validated in mammalian cells. In yeast, aSyn is subjected to several PTM observed in mammalian cells and in PD patient’s brains, namely phosphorylation at S129. Despite the relevance of aSyn phosphorylation on S129, the importance to explore the cross talk between different PTMs has been presented. Therefore, we investigated the role of a set of kinases and phosphatases in aSyn phosphorylation, inclusion formation and toxicity through its co-expression with human aSyn. We showed that there was no strict correlation between the percentage of cells that formed aSyn inclusions and toxicity. Cdc28, a kinase involved in cell cycle, was able to reduce aSyn phosphorylation on S129 in a time-dependent manner. Our results further revealed that the roles of kinases and phosphatases on aSyn toxicity seem to be related, at least in part, to other functions that these proteins play in the cell, and not with a direct alteration of aSyn phosphorylation levels. The function of aSyn is far from clear due to its apparent involvement in many cellular processes. However, converging observations suggest a role as regulator of synaptic vesicular recycling. In yeast cells, vesicular trafficking between the endoplasmic reticulum (ER) and Golgi apparatus (Golgi) was observed as an early defect following aSyn expression. A potential breakthrough in understanding aSyn toxicity in PD resulted from high-copy suppressor screens conducted in yeast, providing the opportunity to search for genes whose co-overexpression restored viability. Subsequent studies showed that aSyn toxicity could be suppressed by overexpression of proteins involved in ER-to-Golgi transport machinery. Since the validation of yeast as a cell model to study aSyn pathobiology, its genetic resources have enabled several screens, in which modifiers of aSyn toxicity were identified. This prompted us to investigate the role of Sly41 in aSyn inclusion formation and toxicity, and the possible interaction between the proteins. Multicopy expression of SLY41 was shown to suppress the loss of YPT1, an essential Rab GTPase required for ER- Golgi transport. The overexpression of Sly41 to the early secretory pathway elevates cytosolic calcium levels to suppress vesicle-tethering mutants. Several lines of evidence indicate that calcium plays a role in regulation of membrane trafficking through the early secretory pathway. In addition, Sly41 was identified as being efficiently packaged into coat protein complex II (COPII) vesicles for trafficking between the ER and Golgi compartments, and its proper localization into ER and Golgi membranes is required for its suppressive activity. We found that yeast cells overexpressing aSyn with Sly41 showed an increase in the percentage of cells with aSyn inclusions, in particular in cells displaying a single inclusion, a phenotype that is different from the expression of aSyn alone. Interestingly, overexpression of SLY41 per si is very toxic and its deletion seems protective under aSyn expression, suggesting a potential toxic effect of Sly41 overexpression related with its function in regulating intracellular calcium levels. Sly41 tagging with a fluorescent protein allowed us to study the co-localization between Sly41 and aSyn, suggesting that the cytotoxic form of aSyn in yeast may associate with transport vesicles as aSyn normally does with synaptic vesicles and that was previously described for Ypt1. Overall, the regulation of intracellular calcium homeostasis is complex and remains poorly understood, and the dissection of its possible role in aSyn aggregation may provide valuable insights into PD pathobiology. Clearly, the challenges for the future will continue in exploring the effect of the aSyn proteotoxicity and understanding how this major pathological protein becomes phosphorylated and the extent to which PTMs impact upon the aggregation of the protein. This may provide key insights into PD etiology. Notably, our study identified additional modifiers of aSyn aggregation and toxicity involved in a variety of cellular functions, suggesting a variety of novel proteins able to modulate aSyn pathobiology.The studies presented in this dissertation were performed within the Cell and Molecular Neuroscience research group, at the Chronic Diseases Research Center (CEDOC), Nova Medical School, Universidade Nova de Lisboa, under the supervision of Tiago F. Outeiro, Ph.D. and Cecília M. P. Rodrigues, Ph.D