Genomic deletions in Escherichia coli K-12 MG1655 for plasmid DNA production

Tese de mestrado em Microbiologia Aplicada, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017A terapia genética e as vacinas de DNA representam um avanço no tratamento de doenças como infeções virais, doenças genéticas e adquiridas. Do ponto de vista de produção, é importante estabelecer um processo rentável com uma relação custo-produção reduzida. Assim, nos últimos anos a investigação tem otimizado e melhorado as condições de produção, bem como modificado geneticamente algumas estirpes bacterianas para tornar rentável a produção de vetores hipotéticos. Os vetores de DNA plasmídico (pDNA) proporcionam benefícios consideráveis em relação aos sistemas virais em aplicações de terapia e vacinação baseadas em genes, incluindo maior estabilidade, baixa imunogenicidade e toxicidade e produção simples em grande escala. No entanto, também mostra baixa eficácia de transfeção e requer o uso à escala de miligramas de pDNA de qualidade farmacêutica por paciente, o que implica esforços de produção extensivos. A fim de satisfazer os requisitos de produção de pDNA elevada, são necessárias estirpes geneticamente modificadas especialmente concebidas para alcançar rendimentos elevados na produção de pDNA. Esta dissertação de mestrado deu continuidade a um trabalho anterior com o objetivo de modificar geneticamente estirpes de Escherichia coli (E. coli) MG1655 através da deleção de genes alvo (pgi, endA e recA), recorrendo ao método λ-Red descrito por Datsenko e Wanner, e posteriormente, comparar os seus padrões de cinética de crescimento com a estirpe original. Os genes selecionados para deleção desempenham diferentes funções no metabolismo de E. coli estando diretamente relacionados com a produção de nucleótidos e produção de DNA plasmídico. O gene pgi é responsável por codificar a enzima fosfoglucose isomerase, a qual catalisa a conversão da glucose-6-fosfato em frutose-6-fosfato, correspondendo à primeira etapa da glicólise. A deleção deste gene conduz a um redireccionamento do fluxo de carbono para a via dos fosfatos de pentose, o que leva a um aumento da síntese de nucleótidos (R5P e E4P), necessários para a síntese de DNA plasmídico. Esta alteração fornece ainda elevadas quantidades de poder redutor (NADPH). O gene endA é responsável por codificar uma endonuclease não especifica, enquanto o gene recA participa no sistema de reparação da estirpe por recombinação homóloga de sequências. A deleção dos genes endA e recA minimiza a digestão inespecífica do DNA plasmídico bem como a sua recombinação. O resultado da deleção dos três genes descritos anteriormente foi a criação da estirpe GALGNEW. Esta estirpe foi comparada com a estirpe mutante previamente criada, GALG20, bem como com a estirpe original MG1655. Antes de realizados os ensaios de crescimento, todas as estirpes foram transformadas com o plasmídeo pVAX1GFP. Neste projeto foi investigada a natureza e a frequência da deleção genómica não intencional de 20 kb, derivada do prófago rac. Esta deleção surge quando estirpes de E. coli K-12 MG1655 são deletadas no gene pgi, usando o método λ-Red descrito por Datsenko e Wanner. Este fenómeno foi verificado após a criação da estirpe GALG20 por sequenciação, não tendo sido encontrada nenhuma leitura de amplificação “read” no genoma da estirpe naquele local. Através de métodos de análise molecular, nomeadamente: reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciação de nova geração (NGS) MiSeq®, a presença da sequência rac foi confirmada no genoma da nova estirpe GALGNEW. As reações de PCR realizadas envolveram pares de oligonucleótidos sintetizados a montante, a jusante e na própria região de 20 kb. Tal como descrito por Liu et al. (2015), a presença de genes de prófagos fornece múltiplos benefícios ao hospedeiro, afim deste sobreviver em ambientes com condições adversas, sendo exemplos: sob stresses oxidativo, ácido, osmótico e sob stress causado pela presença de antibióticos no meio de crescimento. A deleção da sequência rac conduz a um decréscimo da resistência do hospedeiro aos stresses mencionados, tornando a estirpe mais suscetível. Um objetivo adicional deste trabalho foi a construção de uma nova estirpe deletada no gene zwf a partir da estirpe GALGNEW, aplicando um método designado CRISPR- Cas9 descrito por Reish e Prather. Este último objetivo não foi concluído. Diversas diferenças foram encontradas entre os dois métodos de deleção de genes. Contrariamente ao método λ-Red descrito por Datsenko e Wanner, este novo método (CRISPR-Cas9) não requer a síntese por PCR de uma sequência portadora do gene que fornece resistência ao antibiótico canamicina, designada cassete de canamicina, e são utilizados três plasmídeos para transformação. O método CRISPR-Cas9 tem por base a transformação da estirpe hospedeira com um plasmídeo que carrega o gene cas9, o qual codifica uma endonuclease responsável por fazer um “nick” em cadeia simples. O local onde a enzima corta é específico e definido pela escolha de uma região composta por um tripleto (NGG) designada PAM, a qual se localiza na região do gene a deletar. No fim de confirmada a deleção do gene alvo, a estirpe é transformada com um terceiro plasmídeo (pKDsg-p15) para curar o primeiro (pCas9cr4). Contudo, existem características comuns a estes dois métodos, sendo exemplos: (a) a presença dos genes λ-Red (exo, bet e gam), introduzidos num segundo plasmídeo (pKD46 no método λ-Red e pKDsg-xxx método CRISPR-Cas9) e que vão permitir a recombinação entre o fragmento de interesse e o genoma da estirpe hospedeira e (b) a termossensibilidade do segundo plasmídeo. Relativamente ao gene zwf, este é responsável por codificar a enzima glucose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH), sendo esta fundamental no metabolismo central uma vez que se encontra envolvida na divisão do carbono entre a glicólise e a via dos fosfatos de pentose. Com a deleção deste gene é esperado uma restruturação do fluxo de carbono de E. coli para vias alternativas. Apresentando dados mais concretos, as estirpes mutadas no gene zwf conseguem direcionar 98.9% e 87.0% do fluxo total de carbono através da primeira etapa da glicólise e do ciclo dos ácidos tricarboxílicos (pela conversão de acetil-coenzima A em citrato). Quando feita a mesma análise na estirpe original não mutada, verifica-se que o fluxo de carbono é menor na primeira etapa da glicólise (78.6%) e na mesma etapa do ciclo dos ácidos tricarboxílicos (73.1%). Todavia, as estirpes GALG20 e GALGNEW apresentam ligeiras diferenças ao nível de cinética de crescimento (31.4 ± 2.0 and 32.6 ± 2.7, respectivamente) e de rendimento de produção de plasmídeos [169.2 ± 14.3 (mg/ L) e 204.3 ± 44.3 (mg/ L), respetivamente]. Tal como era expectável, estas duas estirpes mutantes mostram rendimentos volumétricos e de produção de plasmídeo mais elevados, quando comparadas com a estirpe original E. coli MG1655.The interest in plasmid DNA (pDNA) as a biopharmaceutical has been increasing over the last few years, especially after the approval of the first DNA vaccines. Gene therapy and DNA vaccines represent a promise in the treatment of diseases like viral infections, genetic and acquired diseases. From the point of view of manufacture, it is important to establish a profitable process with a low cost-production relation. So, over the last years the investigation has optimized and improved the production conditions as well as genetically modifying some bacterial strains to turn the production of hypothetical vectors profitable. pDNA vectors offer considerable benefits over viral systems in gene-based therapy and vaccination applications, including higher shelf stability, low immunogenicity and toxicity, and simple manufacture in large scale. However, also shows low transfection efficacy, and requires milligram scale of pharmaceutical-grade pDNA per patient, which implies extensive production efforts. In order to fulfil high pDNA production requirements, genetically engineered strains specially designed to achieve high pDNA yields are required. This master thesis was a follow up on a previous work aiming at genetically modifying Escherichia coli strains. To explore the effect of strain genetic background, a new pDNA production strain, mutated in of three genes pgi, endA and recA (GALG20), was previously constructed. However, as an unintentional genomic deletion of the 20 kb, derived from rac prophage, appeared in GALG20, a new derivative from MG1655 deleted in pgi, endA and recA genes was constructed (GALGNEW) using λ-Red System described by Datsenko and Wanner [1]. This new strain was compared with GALG20, and with the wild-type strain MG1655. However, contrary to expected, GALG20 and GALGNEW strains show slight differences in growth kinetics (31.4 ± 2.0 and 32.6 ± 2.7, respectively) and plasmid production yields [169.2 ± 14.3 (mg/ L) and 204.3 ± 44.3 (mg/ L), respectively]. As expected, these two mutant strains show higher volumetric and specific plasmid production yields, when comparing with E. coli MG1655. An additional goal of this work was to construct zwf deletion mutants of GALGNEW, using the CRISPR- Cas9 System instead of the λ-Red method. This last goal was not concluded