The intermediate mesoderm, a new player in the establishment of organ laterality?

Tese de mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017A simetria bilateral é uma característica comum nos vertebrados. No entanto, os nossos órgãos internos, tais como o coração, intestino, pâncreas e fígado, estão assimetricamente posicionados no que diz respeito ao eixo Esquerda-Direita (ED) de uma forma conservada chamada “situs solitus”. O estabelecimento da assimetria ED é um passo crucial na organogénese e envolve uma série de eventos moleculares e morfogenéticos. Caso ocorram anomalias durante o estabelecimento da assimetria, estas podem levar a situações incompatíveis com a vida. No peixe-zebra, este processo começa com a quebra da simetria, na qual, os transportadores de iões, que estão assimetricamente distribuídos durante a clivagem no embrião, criam diferenças no potencial de voltagem da membrana assim como no pH entre o lado esquerdo e direito. Depois disto, o organizador ED, que se chama vesicula de Kupffer (KV) no peixe-zebra, é formado, num processo que se inicia entre as 4 e as 6 horas-pós-fertilização (hpf), a partir de um grupo de células localizadas numa zona adjacente ao escudo embrionário, as dorsal forerunner cells (DFC). Quando a KV está formada, uma libertação assimétrica de cálcio ativa a cascata Nodal (sinalização TGF-β). A primeira proteína a ser expressa assimetricamente é a proteína secretada Dand5, que pertence à família Cerberus/Dan, que é uma conhecida inibidora de TGF-β. Esta proteína está expressa do lado direito da KV e antagoniza Spaw (Nodal-related) do lado direito que vai viajar desde a KV em direção à Mesoderme Lateral (LPM) esquerda através de mecanismos ainda não conhecidos entre os estádios de 10 e 12 somitos. Na LPM esquerda, Spaw vai induzir a sua própria expressão, por feedback positivo, bem como a dos seus reguladores negativos, os genes lefty, e o factor de transcrição homeobox pitx2. Os mecanismos morfogenéticos que acontecem downsteam de Pitx2 vão promover o estabelecimento da assimetria dos órgãos. Normalmente consideramos que os eventos que acontecem na LPM controlam a assimetria do coração, intestino, fígado e pâncreas. No entanto apenas o coração deriva exclusivamente da LPM, enquanto os restantes órgãos previamente enumerados provêm maioritariamente de uma associação entre a LPM e a endoderme. No peixe-zebra, o coração é o primeiro órgão a tornar-se assimétrico de forma a adquirir a sua conformação e função. Para que isso aconteça, dois eventos específicos de assimetria ocorrem, um entre as 24 e as 36 hpf (o jog do coração), e o segundo imediatamente depois até as 48 hpf, denominado de loop do coração. Estes processos estão, respetivamente, direta e indiretamente sob a influência da sinalização Nodal. Neste organismo, a torção do intestino dá-se entre as 26 e as 30 hpf na zona que corresponde aos somitos 1 a 3. Para que este processo ocorra a LPM tem que migrar assimetricamente levando à torção do intestino. No entanto ainda não é conhecida como é que os sinais ED são transferidos desde a KV até à LPM esquerda. Neste projeto, nós propomos que a Mesoderme Intermédia (IM), um tecido embrionário, e/ou os Pronéferos (PN), um dos derivados da IM, possam ter um papel durante o estabelecimento da assimetria ED, no peixe-zebra. Propomos que este papel se dê através da ação da proteína de adesão Caderina-11 (Cdh11), um tipo de molécula já implicada no estabelecimento da assimetria ED em galinha e na Drosophila. A nossa hipótese assume a IM como um possível mediador da transferência de Spaw da KV para a LPM entre os estádios de 10 a 12 somitos. Relativamente aos PN, nós propomos que possam atuar como uma estrutura de suporte para a migração assimétrica da LPM que tem como finalidade a torção do intestino para a esquerda. Quando se elimina com o auxilio de um morfolino (MO) a Cdh11, podemos ver que, na maioria dos embriões afetados, parece não ter havido quebra de simetria no que diz respeito ao coração, e que a assimetria do intestino foi revertida. Este resultado sugere que o estabelecimento da assimetria ED ao longo do eixo Anterior-Posterior pode ser promovida em diferentes módulos. Quando analisamos a expressão de spaw e pitx2 em embriões injetados com o MO da Cdh11 verificamos que estes estão maioritariamente expressos na LPM direita (expressão revertida). Sabe-se que a migração assimétrica da LPM que leva à torção do intestino está dependente de sinais utilizados durante o estabelecimento da assimetria ED. Esta expressão de spaw na LPM direita consegue explicar a reversão do intestino observada nesta condição, mas não consegue explicar o fenótipo observado no coração. No entanto, propomos que a Cdh11 possa estar a influenciar a expansão anterior de spaw e de pitx2. A falta da expressão destes genes nos territórios da LPM anterior, que vão dar origem ao coração, não irão permitir a quebra da simetria deste órgão. Durante este projeto nós não fomos capazes de identificar esta molécula nos tecidos associados à assimetria ED, no entanto, esta hipótese levanta a questão da presença da Cdh11 na KV. Mais ensaios têm que ser feitos, de forma a responder de forma definitiva a esta questão. Uma vez que os resultados obtidos com recurso a MOs tem sido questionada, resolvemos analisar um mutante para a Cdh11 como técnica complementar. Para isso encomendamos do European Zebrafish Resource Center um mutante no qual uma mutação pontual no 454º aminoácido que leva à formação de um codão STOP prematuro e por consequência, caso a proteína seja formada, esta será truncada. Ao analisar este mutante não fomos capazes de reproduzir nenhum dos fenótipos obtidos previamente publicados, nem como os obtidos no decorrer deste trabalho usando o MO para Cdh11. Esta análise levantou algumas questões não só em relação à especificidade do MO, como se o mutante é nulo ou não. De forma a perceber em que cenário nos encontramos, iremos realizar alguns testes, tais como “rescues”, Microarray ou RNA sequencing, e também gerar um novo mutante para a Cdh11. Apesar de não termos ainda provas do papel da IM no estabelecimento da assimetria ED através da Cdh11, não queremos deixar esta ideia de lado. Utilizando outros genes e técnicas, tais como a análise de mutantes simples para pax2a, pax8 e ors e mutantes duplos para pax2 e pax8, e ainda gerar e analisar uma linha de ablação para Caderina 17, pretendemos avaliar a necessidade deste tecido no estabelecimento da assimetria ED.External bilateral symmetry in vertebrates hides internal organ asymmetries. The establishment of these asymmetries is a crucial initial step in organogenesis and results from a series of molecular and morphogenetic events. In zebrafish, the establishment of the Left-Right (LR) asymmetry occurs essentially in four main steps: the breaking of bilateral symmetry during the cleavage stages, the formation of the Kupffer's vesicle (KV) at early somitogenesis, the activation of the Nodal Cascade in the lateral plate mesoderm (LPM), and the left- or right-specific morphogenesis of the organs. However, the processes through which communication is established between the KV and the LPM and the morphogenetic dynamics that potentiate, liver, pancreas and gut asymmetries are still poorly understood. In this work, we propose that the Intermediate Mesoderm (IM), an embryonic tissue that lays between the LPM and the KV, or its derivative, the Pronephros (PN), might play a role in the establishment of LR asymmetry in zebrafish. We propose that this role could be done through the action of Cadherin-11 (Cdh11) protein. This type of adhesion molecules has already been implicated in the LR asymmetry in other organisms. Our hypothesis assumes that the IM could work as a mediator of the transfer of Spaw from the KV to the LPM at 10 to 12-somite stages. Regarding the PN, we envision that they could work as stable structure to sustain the LPM asymmetric migration that ultimately leads to the initial shift of the gut tube to the left side of the body. A loss-of-function approach to knockdown Cdh11 revealed that the majority of the affected embryos exhibit laterality defects in the gut (reversed phenotype) and in the heart (No Loop). The lack of concordance between the laterality of the gut and heart suggest that the establishment of LR asymmetry along the AP axis reinforces the idea that laterality is promoted by different modules. It is known that asymmetric LPM migration is dependent on the normal LR pathway cues and is essential to impose the laterality of the gut. The analysis of the expression of the conserved LR genes (spaw and pitx2), that are expressed, in the majority of the morphant embryos, on the right LPM instead of the left LPM, can explain the reversion observed in the gut in this condition but cannot explain the one detected in the heart. We propose that Cdh11 could influence the anterior expression of spaw and consequentially pitx2 in the LPM, and that the lack of these genes in the anterior heart prospective territory would not allow the break of symmetry. During this project we were not able to detect the Cdh11 in any of the known LR patterning tissues, however this result raises the question that Cdh11 could work at the KV level. More assays need to be done in order to address this question. We also ordered and analyzed a cdh11 mutant as a complementary approach. We were not able to reproduce any of the phenotypes observed with the cdh11MO. This assay raises questions about the cdh11 MO specificity and the quality of the null cdh11 mutant. To understand which scenario is true, we will perform a series of tests such as “rescues”, microarray or RNA sequencing and even generate a new cdh11 mutant. Even though we were not able to produce any convincing evidence that the IM plays a role in the establishment of LR asymmetry, through the expression of Cdh11, we want to further investigate the necessity of this tissue in LR asymmetry using other approaches. Therefore, we will analyze IM mutants as well as generate a targeted cell ablation line under the control of the Cdh17 promoter