Characterization of voltage-gated potassium channels from dorsal root ganglia neurons in neuropathic and inflammatory chronic pain

Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017Dor cronica afeta 21% da população humana e, ate a data, os tratamentos disponíveis são apenas parcialmente eficazes. Esta condicao resulta, muitas vezes, em perturbação de sono, desenvolvimento de depressão e ansiedade que prejudicam a qualidade de vida dos pacientes. Uma das formas mais incapacitantes da dor cronica e a dor neuropática, resultante de lesões nos nervos sensoriais. Existem muitas outras etiologias de dor cronica como por exemplo a inflamatória (artrite reumática) e a neuropática diabética. Em dor cronica, os doentes sofrem de hiperalgesia (reacção exagerada a um estimulo doloroso), alodínia (sensação de dor a um estímulo não doloroso), dor espontânea, parestesia (sensação anormal) e disestesia (parestesia desconfortável). A dor cronica e especialmente difícil de tratar muito porque não se compreende totalmente os mecanismos moleculares que a causam. Atualmente, o tratamento da dor crónica continua a ser um desafio pois a maioria dos alvos das atuais abordagens terapêuticas coexistem no sistema nervoso central e, por isso, promovem vários efeitos colaterais tais como dependência e habituação. As fibras sensoriais que são responsáveis pela transmissão de estímulos de dor (fibras C e Aδ) encontram-se num estado mais elevado de hiperexcitabilidade numa situação de dor cronica. Tal excitação e controlada por um conjunto de canais iónicos ativados por voltagem (entre outros) que produzem um grau de excitação que e, numa situação normal, proporcional a intensidade do estimulo externo. No contexto de nervo sensorial danificado, este torna-se hiperativo e produz atividade elétrica espontânea que o cérebro interpreta como sinais de dor. Tal pode se traduzir numa situação de dor crónica, onde a coordenação e interrompida, resultando em excitabilidade periférica desregulada. A velocidade de transmissão nas fibras C e mais lenta relativamente a velocidade de transmissão das fibras Aδ devido a ausência de um revestimento de mielina. Desta forma, a perceção dos estímulos transmitidos pelas fibras C e mais difusa que das fibras Aδ. As fibras sensoriais primarias ou nocicetivas são constituídas pelos neurónios do gânglio da raiz dorsal (DRG, do inglês Dorsal Root Ganglia). Os neurónios DRG de pequeno diâmetro apresentam uma atividade aumentada em pacientes com dor crónica, e por isso serão o foco desta dissertação. Na presença de estímulos capazes de produzir dor (ou seja, cuja magnitude e superior ao limiar de ativação das fibras nervosas) os recetores nas terminações nervosas dos neurónios primários são ativados, despolarizando a membrana e produzindo um potencial de ação. Esta despolarização propaga-se pela fibra nervosa, sendo o sinal transmitido para os neurónios secundários e sistema nervoso central onde, no córtex sensorial do cérebro, a informação a relativa a quantificação e localização da dor e integrada. O papel dos canais de K+ no controlo do potencial de repouso da membrana, no limiar de disparo, frequência e forma do potencial de ação e crucial. Estudos indicam que a inibição dos canais de K+ induz a atividade espontânea em fibras sensoriais periféricas, cuja hiperexcitabilidade em estados de dor cronica coincidiu com a sua regulação negativa. Assim, a supressão da condutância de K+ pode representar uma condição geral de um nervo 'doloroso'. A diminuição da atividade dos canais de K+ ativados por voltagem faz parte de um mecanismo geral para a hiperneuroexcitabilidade periférica em dor crónica, e que potenciadores destes canais podem significar um melhoramento desta doença. O objetivo do trabalho experimental foi a elucidação dos mecanismos comuns e específicos de dor cronica com origem neuropática e inflamatória em modelos de ratos. A compreensão da base mecanística do mau funcionamento de canais de K+ ativados por voltagem (Kv) em termos de localização, biofísica, e consequências para a neuro transmissão e uma potencial de novas terapias para a dor. Especificamente, foi estudada a biofísica de canais Kv em neurónios de DRG de pequeno diâmetro. Sabendo que a dor crónica pode ter varias etiologias, este projeto focou-se na dor crónica de origem inflamatória e neuropática, baseando-se em modelos animais de dor em ratos. A dor cronica neuropática foi estudada com base no modelo Chronic Constriction Injury (CCI) que assenta na constrição cronica do nervo isquiático do rato através de quatro nos soltos. A dor crónica inflamatória foi estudada através da indução de monoartrite no joelho do rato, pela injeção de uma substância que ativa o sistema imunitário: Complete Freund’s Adjuvant (CFA). O desenvolvimento de dor crónica foi acompanhado por testes comportamentais que incluem a medição de sensibilidade mecânica e de atividade vertical. Ao fim de 4 semanas (para CCI) e de 2 semanas (para CFA), os ratos foram sacrificados por decapitação após anestesia com pentobarbital para análise dos neurónios DRG de pequeno diâmetro por eletrofisiologia. No modelo neuropático CCI, os ratos modelo desenvolveram hiperalgesia durante o curso da experiencia mantendo-a sempre abaixo dos respetivos controlos. No modelo inflamatório CFA foi observada inicialmente uma maior sensibilidade apos a indução do modelo, evoluindo para uma recuperação total da sensibilidade no final do tempo do modelo. Resultados de whole-cell voltage-clamp demonstram que a dor cronica altera as propriedades biofísicas das correntes dos canais de K+ ativados por voltagem. Especificamente, ambos os modelos CCI e CFA partilham um mecanismo relativo a redução da componente rápida das correntes de K+. O modelo de dor cronica neuropática mostra ainda um mecanismo específico subjacente de aumento da componente lenta das correntes de K+. Os ensaios proteicos revelaram uma expressão aumentada de Kv1.3 (uma isoforma de canais de K+ ativados por voltagem), a qual aparenta ser responsável por este aumento da componente lenta. O modelo de dor crónica inflamatória mostra uma alteração especifica relativa a uma despolarização do perfil de ativação da componente rápida das correntes de K+, sugerindo uma alteração de sensibilidade a voltagem para valores mais despolarizados. No seu conjunto, os dados apontam para a identificação de componentes da corrente de K+ que estão diferencialmente expressas nos modelos de dor crónica. Esta informação em combinação com os ensaios de expressão proteica sugerem a identificação molecular das componentes da corrente de K+. Os resultados conseguidos durante esta tese de mestrado trouxeram novos conhecimentos para a validação de alvos dor moleculares terapêuticos e para a identificação de novas abordagens experimentais / terapêuticas para dor neuropática e inflamatória, bem como o seu mecanismo de ação, que continuara a ser explorado pelo laboratório.Chronic pain affects 21% of the human population and, to date, standard treatments are only partially effective. This condition often results in poor sleep, depression and anxiety, between other, which highly impair patients’ quality of life. One of the most disabling forms of chronic pain is called neuropathic pain, which results from injuries to sensory nerves. Pain or discomfort is felt in response to non-painful stimuli. Chronic pain is difficult to treat as currently we do not fully understand the associated molecular mechanisms. Stimulating a nerve above the threshold of activation causes it to produce action potentials. Neurotransmission follows action potentials which are generated by ions moving into and out of the neuronal-membrane through voltage-gated ionic channel. Voltagegated sodium and potassium channels (Nav and Kv, respectively) are critical to the generation of these action potentials that convey nociceptor signals to synapses in the dorsal horn. In this context, nociceptive fibers that are responsible for the transmission of pain stimuli are in a higher state of excitability with pain. Such excitation is controlled by an intricate set of ion channels that are coordinated to produce a degree of excitation that, in a naive situation, is proportional to the strength of the external stimulation. Once a sensory nerve is damaged or injured it becomes hyperactive and produces spontaneous electrical activity that the brain interprets as pain signals. In chronic pain coordination by ion channels is disrupted, resulting in deregulated peripheral excitability. Of those sensory fibers, small diameter dorsal root ganglia (DRG) neurons are found to have an augmented activity in chronic pain patients. There is strong evidence that modulation of specific Na+, Calcium (Ca2+) or K+ channel sub-types can be effective in treating chronic pain, although there is still no modulator on the clinical setting specifically targeting those channels expressed in painsensing neurons from DRG. Moreover, it is not fully understood how chronic pain affects the ion channel dynamics in a way that generates this hyperactivity. The goal of the present work was to elucidate shared and specific mechanisms of neuropathic and inflammatory chronic pain involving K+ channels, using pain rat models. Understanding the mechanistic basis of ion channel malfunction in terms of trafficking, localization, biophysics, and consequences for neurotransmission is a potential route to new pain therapies. Specifically, we studied the biophysics of voltage activated K+ currents and underlying Kv channels in small diameter DRG neurons and determine routes of pharmacological modulation of these currents as a strategy for new analgesic drug design. Knowing that chronic pain can have several etiologies, this project focused on chronic pain of neuropathic and inflammatory origin, based on rat models of pain. Chronic neuropathic pain was studied based on Chronic Constriction Injury (CCI) , which is based on the chronic constriction of the rat sciatic nerve through four loose ligation Chronic inflammatory pain was studied through the induction of mono arthritis in the knee of the rat by the injection of a substance that activates the immune system: Complete Freund's Adjuvant (CFA). The pain models were followed with behavioral tests that included the measurement of mechanical sensitivity and vertical activity. After 4 weeks (for the CCI) and 2 weeks (for the CFA model), rats were sacrificed and their DRG removed aiming the electrophysiological analysis from small diameter DRG neurons. In the neuropathic CCI model, the model rats developed hyperalgesia during the experiment, keeping their threshold for pain below the respective controls. In the inflammatory CFA model, a greater sensitivity was observed by the third day after model induction, progressing to a full recovery of sensitivity at the end of the model time. Whole-cell voltage-clamp results demonstrated that chronic pain alters the biophysical properties of voltage-activated K+ channel currents. Importantly, both CCI and CFA models share a mechanism, a reduction of the fast component of K+ current (Ifast, an Atype current). The neurons from the CCI pain model also showed a specific current output: an increase of current density of the slow K+ current component (Islow). Western-blot protein assays revealed over expression of Kv1.3, which may be responsible for this increase in Islow. In terms of channel gating phenomena, neurons from CFA rats showed a specific biophysical alteration – in relation to neurons from naive rats, the voltage dependence of activation showed more depolarized curves. Finally, in terms of the voltage dependence of steady-state inactivation, neurons from both pain rat models exhibited more depolarized voltage profiles. Such impairment of the inactivation is concordant with the alleged increase excitability in damaged neurons. Taken together, the data reveals mechanisms underlying increases in neuro excitability which lead to neuronal hyperactivity and hyperalgesia. The results also points to the identification of specific and shared phenomena occurring in K+ current components that are differentially expressed in the pain models. This information, together with the protein expression assays, suggest the molecular identification of the K+ current component. The results obtained during this master's thesis bring new knowledge about the therapeutic molecular pain targets and for the identification of new experimental / therapeutic approaches for neuropathic chronic pain and inflammatory pain, as well as its underlying mechanisms, which will continue to be explored by the host laboratory