Characterization of Klesiella pneumoniae bacteriocalins

Tese de mestrado em Microbiologia Aplicada, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016Desde a descoberta dos primeiros antibióticos em meados do seculo XX, que estes têm vindo a ser utilizados, frequentemente, de forma indiscriminada para combater infeções bacterianas, o que tem sido associado a um aumento do número de infeções causadas por bactérias multirresistentes (MDRs). Apesar de várias medidas terem sido já implementadas para evitar a incidência de microrganismos multirresistentes, estas têm-se mostrado ineficazes, ficando a comunidade científica responsável por encontrar novas formas de combater os mecanismos de resistência bacterianos. Um dos mecanismos recentemente descritos envolve a actuação de proteínas denominadas lipocalinas bacterianas (BCNs, anteriormente conhecidas por YceI). Inicialmente descritas em Burkholderia cenocepacia K56-2, estas proteínas são secretadas pelas bactérias capturando antibióticos hidrofóbicos no meio extracelular, impedindo o antibiótico de atuar sobre a bactéria, aumentando assim a concentração mínima inibitória (CIM) do respetivo antibiótico. Este mecanismo não aparente ser restrito às bactérias produtoras de BCNs, exercendo actividade e proteção sobre a comunidade bacteriana envolvente. As BCNs consistem em proteínas de baixa massa molecular, altamente conservadas entre as bactérias, apresentando uma conformação característica tridimensional (3D) de barril-β, seguida por uma hélice-α. Geralmente secretadas para o meio periplasmático, livres ou ancoradas à membrana plasmática, estas proteinas podem ainda surgir no meio extracelular ou, ainda, no citosol da bactéria. As BCNs descritas até à data ainda se encontram muito pouco caracterizadas funcionalmente, desconhecendo-se a capacidade de ligação de proteínas ortologas das descritas originalmente em alguns organismos aos antibioticos. Desta forma, esta tese focou-se no estudo do homólogo de BCN em Klebsiella pneumoniae kp52.145 designado BcnK. Esta bactéria Gram-negativa, pertencente à família das Enterobacteriaceae, é um importante agente patogénico responsável por surtos de pneumonia, entres outras infeções, em ambientes hospitalares e na comunidade. Tal como se verifica com outros agentes patogénicos, o número de estirpes de K. pneumoniae multirresistentes tem vindo a aumentar. Os principais mecanismos de resistência presentes nas estirpes clínicas desta espécie consistem em: (i) produção de β-lactamases de largo espectro de atuação, capazes de hidrolisar cefalosporinas e antibióticos do grupo dos monobactâmicos, ou (ii) produção de carbapenemases, que possuem a capacidade de hidrolisar um largo espectro de antibióticos, incluindo carbapenemes. Estes genes possuem a capacidade de se propagar horizontalmente entre estirpes da mesma ou outras espécies, tendo sido detetadas em várias regiões do mundo, constituindo assim uma ameaça para a saúde pública. Assim, a fim de se caracterizar funcionalmente a proteína BcnK, o gene correspondente (bcnK) foi expresso por clonagem em Escherichia coli no vetor pDA-CTHis, contendo uma cauda de seis histidinas na extremidade C-terminal, dando origem a pDG1. A proteína recombinante expressa foi purificada com sucesso por cromatografia de afinidade. A verificação da expressão desta proteína foi efectuada através de SDS-PAGE e Western-blot. Apesar de se ter verificado que a expressão de BcnK conferiu um aumento da CMI, traduzido por uma diferença de crescimento de cerca de 65.5% OD600 a uma concentração de 1.0 μg/mL de polimixina B, em testes de proteção com Pseudomonas aeruginosa PAO1, não foi possível repetir este ensaio devido à agregação da proteína observada durante a diálise em tampão PBS, o que impossibilitou a quantificação da proteína e a sua utilização em ensaios subsequentes. Especula-se que a agregação observada se deveu, possivelmente, à componente lipídica N-acil-S-sn-1,2-diacilcerilcisteína presente na exterminade N-terminal de BcnK. Desta forma, procedeu-se a nova tentativa de clonagem de bcnK no mesmo vetor, removendo-se a sequência do péptido sinal. Contudo, não se obtiveram quantidades suficientes da proteína produzida para se proceder à sua purificação. Assim, alternativamente, clonou-se bcnK no vetor induzível por IPTG, pET-28a (+), contendo caudas de histidina nas extremidades N- e C- terminal (pDG7) e, em paralelo, clonou-se no mesmo vetor, usando apenas uma cauda de histidinas na extremidade N-terminal (pDG8). A expressão do gene bcnK nestes vetores levou à produção de quantidades suficientes de proteína para purificação. No entanto, a expressão da construção genética em pDG7 conduziu a elevados níveis de agregação da proteína durante a diálise, possivelmente devido à presença das caudas de histidina. Contrariamente ao esperado, a expressão de BcnK em pDG8 não conduziu ao aumento da CMI nos ensaios de proteção. Desta forma, admitiu-se a hipótese de que a proteína recombinante produzida sem péptido sinal teria uma conformação incorreta para o exercício da sua função biológica ou de que a cauda de histidinas presente na extremidade N-terminal pudesse gerar interferência com a atividade da proteína. Um novo plasmídeo foi construído utilizando o vetor pUC19 contendo uma caude de histidinas na extremidade C-terminal. Contudo, a expressão neste plasmídeo também não produziu quantidades suficientes de proteína para purificação. Uma nova abordagem será realizada ao clonar bcnK num vector contendo um péptido sinal, secretando BcnK para o espaço perisplásmico sem a componente lipidica N-acil-S-sn-1,2-diacilcerilcisteína, permitindo a solubilização da proteína. De forma a investigar o papel de BcnK na resistência a antibióticos exibida por K. pneumoniae, tentou-se inativar bcnK no genoma bacteriano por duas metodologias, através de mutagénese dirigida não marcada, o que permitiria a obtanção de um mutante de eliminação isogénico, e através de mutação por inserção, por recurso aos plasmídeos construídos neste trabalho, pDG2 e pDG9, respetivamente. No entanto, não foram obtidos mutantes por quaiquer dos métodos, tendo-se obtido mutantes merodiplóides apenas na estratégia de inativação por mutagénese dirigida não marcada. Assim, em alternativa, procurou-se testar a essencialidade de BcnK por expressão de bcnK sob o controlo de um promotor induzível por ramnose. Contudo, foi necessário testar a funcionalidade deste promotor em K. pneumoniae. Para o efeito, utilizou-se o vetor pSCrhaB2-e-GFP, que tem um promotor induzível por ramnose fundido transcricionalmente com o gene GFP (green fluorescent protein), o qual permite a deteção da sua expressão por fluorescência. Conjugou-se em K. pneumoniae, a qual foi crescida em 0.2% e 0.5% de ramnose e 0.5% glucose, respetivamente, tendo-se registado fluorescência na presença das diferentes concentrações de ramnose e, por outro lado, a ausência de fluorescência na presença de glucose, o que sugere o correto funcionamento do promotor no hospedeiro K. pneumoniae. Um fragmento de bcnK foi então clonado no vetor suicida contendo um promotor induzível por ramnose pSC200, dando origem a pDG10, sendo este posteriormente conjugado em K. pneumoniae. Os transconjugantes obtidos foram crescidos em meio M9 contendo 0.5% de ramnose (condições permissivas) ou glucose (condições não permissivas). Em ambos os meios, observou-se crescimento, sugerindo que bcnK não é um gene essencial à viabilidade de K. pneumoniae, pensando-se ainda que a expressão de bcnK na presença de glucose, ainda que em níveis basais, poderá ser suficiente para suportar a viabilidade de K. pneumoniae. Informação recolhida durante a pesquisa bibliografica sugere que BcnK intervem ao nivel da cadeia de transporte eletrónico, sendo a expressão de BcnK suprimida em anaerobiose. Desta forma, numa tentativa de se desligar a cadeia de transporte eletrónico, tentou-se mutagenizar bcnK em condições de anaerobiose. Alternativamente, testou-se o papel de BcnK na resposta da célula ao stress oxidativo, usando para o efeito um plasmídeo com um gene repórter que codifica para uma proteína luminescente, a luciferase. Os resultados preliminares mostram o aumento da expressão de PbcnK::luxCDABE e PoxyR::luxCDABE (controlo positivo) nas condições testadas, sem grandes diferenças aparentes. No entanto, pretende-se utilizar no futuro a construção PwaaE::luxCDABE como controlo negativo, pois é previsto que a expressão de waaE não seja induzida por stress oxidativo. O mutante de B. cenocepacia ΔBcnAΔBcnB foi complementado com o plasmídeo pDG1 expressando BcnK para verificação da possibilidade de recuperação do fenótipo em relação à estirpe selvagem. Verificou-se que a complementação com BcnK conduz a níveis de CMI similares aos verificados com a estirpe selvagem, no entanto o mesmo resultado foi obtido quando se introduziu apenas o vetor (controlo), sugerindo que um efeito inespecífico. No entanto, bcnK será clonado no vetor pSCrhaB2, vetor este utilizado originalmente nos estudos de complementação em B. cenocepacia. O alinhamento das sequências aminoacídicas de BcnK e BcnA por recurso à ferramenta Clustal Omega demonstrou que os resíduos Val107 e Glu118 de BcnK parecem corresponder aos resíduos Asp82 e Asp93 de BcnA, respetivamente, que foram demonstrados como essenciais para a ligação de BcnA a antibióticos. Apesar destas evidências in silico, a intervenção dos resíduos correspondentes em BcnK ao nível da ligação com antibióticos permanece por demonstrar experimentalmente. A análise de polimorfismos de BcnK por pesquisa de homologia nas bases de dados internacionais, restringindo a busca ao género Klebsiella, seguida pelo alinhamento das respetivas sequências aminoacídicas, demonstrou que BcnK é altamente conservada neste género (99 a 81% de homologia), contudo desconhece-se ainda a influência das diferenças registadas na função biológica exercida pela proteína a nível celular. O estudo da conservação de genes vizinhos de bcnK por análise de sintenia foi realizado a partir da ferramenta SyntTax. Os resultados obtidos permitiram observar a conservação do locus genético deste gene entre as várias espécies testadas. Em algumas espécies, o gene de BCNs encontra-se associado ao gene que codifica para o citocromo b561 (CybB). Contudo, não foi encontrada sintenia para Enterococcus faecium, Streptococcus pyogenes e Acetobacterium woodii, nos quais se registou a ausência de BCNs e CybB. Estas espécies bacterianas são conhecidas por não possuírem cadeia de transporte eletrónico funcional e por serem anaeróbios restritos. Assim, considerando a globalidade dos resultados obtidos, propõe-se um modelo da funcionalidade das BCNs, sugerindo-se que estas proteínas participam no transporte ou sequestro de compostos hidrofóbicos, tais como quinonas isoprenóides ou vitamina E, especificamente no meio extracelular, por ação de BcnA, ou no meio periplásmico, por ação de BcnB ou BcnK. Estes compostos hidrofóbicos são transportados até CybB, onde são reduzidos, e posteriormente transportados para o meio extracelular e/ou periplásmico, atuando como agentes antioxidantes. Fica, no entanto, por demonstrar experimentalmente este papel.Antibiotic resistant bacteria have become one of the greatest threats to modern society, especially those bacteria that resist multiple antibiotics (referred to as multidrug resistant; MDRs). Although most well known resistance mechanisms operate within bacterial cells, recent evidence suggests extracellular mechanisms. One of such mechanisms involves bacterial lipocalins (BCNs), which are secreted proteins that capture hydrophobic antibiotics in the extracellular space. BCNs are widely distributed in bacteria. Klebsiella pneumoniae, a Gram-negative enteric bacterium, possesses a BCN ortholog. Klebsiella species cause hospital and community-acquired infections and antibiotic resistance is in part due to the spread of β-lactamases. In this thesis, I cloned, expressed and purified a K. pneumoniae kp52.145 BCN (BcnK). Recombinant BcnK proteins were employed in antibiotic protection assays using Pseudomonas aeruginosa PAO1 against polymyxin B (PmB) as a model system. Full-length recombinant BcnK was unstable and formed aggregates that complicated its quantification. However, this protein caused an increase of 65.5% in the OD600 of P. aeruginosa in the presence of sublethal amount of PmB. Other bcnK constructs were made, but either lacked activity or could not be purified. A bcnK chromosomal deletion was attempted using protocol to proceed unmarked deletion and another one to mutate by inserting a polar gene cassette. No mutants were obtained in both cases. K. pneumoniae kp52.145 bcnK gene expression was placed under control of a rhamnose-inducible promoter, but the resulting constructs did exhibit the expected growth defect, showing the same growth phenotype irrespective of the presence of rhamnose (permissive condition) or glucose (non-permissive condition), suggesting that bcnK is not essential for K. pneumoniae viability. I also investigated the regulation of bcnK gene expression. Preliminary results suggest that bcnK expression is upregulated under different concentrations of paraquat, a compound that stimulates the production of oxygen radicals. Recombinant bcnK was used to complement a ΔbcnAΔbcnB Burkholderia cenocepacia mutant by assessing the restoration of rifampicin resistance to parental levels. However, increased resistance could only be attributed to the plasmid vector control but not to the plasmid expressing BcnK. Alignments done using amino acid sequence for BcnK and BcnA from B. cenocepacia J2315 showed two residues, Val107 and Glu118 of BcnK to correspond to Asp82 and Asp93 of BcnA, respectively. Previous reports have shown that these residues, in BcnA, are these residues were shown to be crucial for antibiotic binding. BCN genomic studies showed a highly conserved protein (99 to 81% homology) among Klebsiella species. Synteny and BLASTp results showed that in some species BCNs are associated with a cytochrome b561 (cybB) gene. However, both BCNs and cybB genes are absent in strict anaerobes. I suggest a model of BCNs cellular function that involves the hijacking of hydrophobic compounds, such as isoprenoid quinones, and their transport to the membrane where these compounds are reduced and further transported in the extracellular and/or periplasmic space acting as antioxidants