Optimization of high added-value pigments production by Gordonia alkanivorans strain 1B

Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016Com o aumento das restrições mundiais relativas à concentração de enxofre nos combustíveis fósseis, houve necessidade de estudar processos que removessem este composto. O processo implementado e que está ainda em uso é a hidrodessulfurização. No entanto, esta técnica representa elevados custos, devido às condições extremas que usa, nomeadamente, pressão e temperatura elevadas entre outros. Uma alternativa a este processo é a biodessulfurização que utiliza microrganismos como catalisadores, que usam o enxofre que removem, nas suas vias metabólicas. Este processo tem como principais vantagens relativamente à hidrodessulfurização o facto de ser mais ecológico, e de funcionar em condições amenas (temperaturas e pressão mais baixas). No entanto, os custos associados a este processo ainda continuam a ser um dos fatores limitantes à sua aplicação a nível industrial. Assim, têm vindo a ser feitas tentativas no sentido de minimizar os custos associados à biodessulfurização quer pela minimização do valor associado ao processo (meios de cultura, equipamento, fonte de carbono, entre outros), quer pela exploração de produtos resultantes da atividade dos catalisadores(1–5). De entre vários microrganismos capazes de dessulfurizar estão espécies do género Gordonia, como por exemplo, Gordonia alkanivorans estirpe 1B(6). Esta bactéria é aeróbia, gram-positiva e com uma cor rosa/alaranjada e com elevada capacidade de dessulfurização. Recentemente, Silva et al. descreveram a capacidade de produção de pigmentos, nomeadamente carotenoides, por esta estirpe(7). Os carotenoides são usados principalmente como aditivos e corantes (na piscicultura, por exemplo) ou como suplementos nutricionais. Funcionalmente, são responsáveis por proteger as células de stress oxidativo devido à sua capacidade antioxidante e, como tal, estão associados à prevenção de diversos tipos de cancro. Desempenham também outras funções, tais como estabilização da membrana em bactérias, para além de serem responsáveis pela cor de muitos organismos. São portanto compostos com elevado valor económico(8,9). Existem vários estudos que descrevem condições para otimizar/potenciar a produção de carotenoides, sendo que muitos referem a aplicação de condições de stress sobre os microrganismos. A formulação dos meios de cultura (composição em sais), temperatura de crescimento, oxigenação, fonte de carbono, exposição à luz e a diferentes comprimentos de onda de luz são algumas das condições testadas(10–13). Neste contexto, e dando seguimento ao estudo desenvolvido por Silva et al., este trabalho teve como principal objetivo otimizar as condições de cultura da bactéria G. alkanivorans estirpe 1B com o intuito de maximizar a produção de carotenoides(14). Numa primeira fase, sabendo que a estirpe 1B é frutofílica(15), estudou-se qual a influência da combinação de fontes de carbono, nomeadamente da % de glucose numa mistura de glucose-frutose (0-100% glucose) e da concentração de sulfato (7-37 mg.L-1) na produção de carotenoides por esta bactéria. Para isso fizeram-se dois planeamentos experimentais (PEs) baseados na distribuição de Doehlert(16) para os dois fatores acima referidos, em diferentes condições de luz (400 lux de luz e sem luz). As respostas avaliadas nestes PEs foram a produção da biomassa e dos carotenoides totais, após 72 h e 216 h. Baseado nas diferentes respostas obtidas em ambos os PEs, a melhor condição para produção de carotenoides foi com 100% de glucose e concentração de sulfato ≥22 mg.L-1, na presença de luz durante ≥216 h. Estes resultados mostraram que a luz, tempo, glucose e concentração de sulfato têm grande impacto na produção de carotenoides pela estirpe 1B. Tendo por base a importância do tempo para a maior produção de pigmentos. Avaliou-se o comportamento da estirpe 1B durante o seu crescimento ao longo do período de 26 dias para a produção de pigmentos. Deste modo, a estirpe 1B foi cultivada em frasco agitado, com 10 g.L-1 glucose e 22 mg.L-1 sulfato, sob diferentes condições de luz (L0 - escuro, L400 – 400 lux, L3000 – 3000 lux, com fotoperíodo variando entre 3000-7000 lux). Neste ensaio, L400 obteve a maior taxa de crescimento (0.0259 h-1), seguida de L0 (0.0235 h-1) e por fim L3000 (0.0227 h-1). Considerando a produção de biomassa, as culturas com luz obtiveram 4.2 g.L-1, enquanto que a cultura L0 apenas atingiu 3.5 g.L-1. Como esperado, L0 obteve a produção de carotenoides mais baixa de todos os ensaios, com apenas 220 μg (447 μg.gpeso seco -1), contrastando com o valor de 1609 μg (2596 μg.gpeso seco-1) em L400 e 1455 μg (2359 μg.gpeso seco-1) em L3000. Os resultados das culturas com luz foram os mais elevados obtidos com a estirpe 1B descritos até ao momento (0.24 – 0.26%). Este rendimento, foi ainda melhor num ensaio adicional em que a cultura foi mantida a 3000 lux sem fotoperíodo, atingindo um valor de 0.31% (3100 μg. gpeso seco-1), o melhor de entre outras estirpes de Gordonia. No ensaio, sem luz a produção de carotenoides parou assim que terminou a fase exponencial do crescimento da estirpe 1B, enquanto que, no ensaio com luz, mesmo após a fonte de carbono se ter esgotado continuou a existir produção ao longo do tempo. Os diferentes extratos foram também analisados por HPLC de modo a identificar-se os principais tipos de carotenoides produzidos por G. alkanivorans estirpe 1B. Apenas astaxantina e luteína foram identificadas nos extratos, mas estes carotenoides representam apenas uma parte dos pigmentos totais produzidos (entre 37 a 52%), havendo assim ainda muitos carotenoide por identificar. O ensaio ao longo do tempo foi seguido também por citometria de fluxo de forma a avaliar o estado fisiológico das células, visto existirem diversos estudos que apresentam uma relação direta entre stress e aumento de produção de pigmentos. A maior percentagem de células stressadas/mortas foi obtida nas culturas com maior produção de carotenoides (culturas à luz) com 39%/12% e 32%/8% respetivamente, para L400 e L3000. Por outro lado, L0 apenas teve 18%/1% de células stressadas e mortas, no entanto e consequentemente, esta cultura foi a que obteve maior percentagem de células saudáveis 81% vs. 49% em L400 e 60% em L3000. Estes resultados estão assim de acordo com a literatura, no sentido em que existe uma relação entre elevado stress celular e maior produção de carotenoides. De facto, ao sujeitar as células a stress induzido por luz resultou num aumento da produção de carotenoides de 447 μg. gpeso seco-1 para 2359-2596 μg. gpeso seco-1. Considerando as funções e possíveis aplicações dos carotenoides, o último passo passou por testar a atividade antioxidante e antimicrobiana destes extratos. Na atividade antimicrobiana não foram obtidos resultados positivos. Por outro lado, na atividade antioxidante, as amostras estudadas apresentaram resultados positivos. O melhor resultado foi obtido com o extrato da cultura sem luz, que obteve cerca de 3.4% de descoloração de DPPH•. Considerando que esta amostra tinha 478 μg.L-1 de carotenoides e comparando com o padrão de ácido ascórbico de concentração semelhante (500 μg.L-1), este último apenas teve 1.8% de descoloração, quase metade da atividade do extrato. No entanto, devem ser efetuados mais testes utilizando os pigmentos purificados, uma vez que nos extratos podem existir outros compostos que foram simultaneamente extraídos com os pigmentos e que podem influenciar (positiva ou negativamente) a atividade antioxidante observada. Em conclusão, estes resultados apontam para o interesse em explorar a G.alkanivorans estirpe 1B como híper produtora de pigmentos que poderão ser aplicados em diversas indústrias devido ao seu valor elevado como moléculas bioativas. Torna assim real a possibilidade de aplicar estes compostos a diversas industrias dos mais variados sectores, como químico, farmacêutico, alimentar e cosmético. Não esquecendo que a estirpe 1B é conhecida pelo seu grande potencial para dessulfurizar combustíveis fósseis, a exploração simultânea deste produto de valor acrescentado poderá beneficiar, futuramente, o aumento de escala da BDS para uma aplicação nas fases finais de uma refinaria petrolífera, tornando assim o processo mais rentável.The actinomycetes of the genus Gordonia have been continually gaining interest, mainly due to their ability to degrade a variety of xenobiotics, environmental pollutants between others. They also have the capacity of synthesising organic compounds with commercial interest such as carotenoids. Carotenoids are high added-value compounds, due to their wide application especially as colorants, food additives and also, considering some of their characteristics (antioxidant activity, scavenging, photoprotection, between others), they can be used as bioactive products in nutraceutical. Hence, the increasing interest on these valuable bioactive molecules has led to the search of alternatives, more cost-effective and with higher yields, towards their industrial production. In fact, microbial metabolism offers a promising option for pigments production. Herein, Gordonia alkanivorans strain 1B, a known desulfurizing bacterium, is exploited as a high carotenoid-producer microorganism. The main goal of this work was the optimization of the carotenoids production conditions with further identification of the main type of carotenoids present. In this context, two parallel experimental designs (EDs) were carried out, one in the absence of light (ED1 – L0) and the other at approximately 400 lux light (ED2 – L400), to demonstrate the importance of light factor into carotenoids production even in the same growth conditions of C-source and S-source. Therefore, following the Doehlert distribution based surface response methodology, it was evaluated in both EDs the influence of two factors: % of glucose in a mixture glucose + fructose (0-100% glu in 10 g.L-1), and sulfate concentration (7-37 mg.L-1), for two responses assessed (biomass, total carotenoids). Moreover, two different times were studied to evaluate a possible influence of time: 72 and 216 h. Based on the different response surfaces obtained in both EDs, the best combination for carotenoids production by strain 1B was: 100% glucose and a sulfate concentration higher than 22 mg.L-1 in the presence of light for 216 h. Results demonstrated that light, time period, glucose and sulfate content in the culture medium, played an important role towards the highest carotenoids production by strain 1B. Next, the influence of time was studied in more detail, as well as, the influence of light performing an assay without light, with 400 lux and with photoperiod with a basal value of 3000 lux. In terms of growth, the culture with 400 lux had a higher growth rate than the others. The cultures with light had higher biomass (4.2 g.L-1 instead of 3.5 g.L-1). The highest value of carotenoid production described so far by G. alkanivorans strain 1B was achieved with this assay, reaching a value of 1608.6 μg (2596 μg.gDCW-1) in the culture with 400 lux and 21 days of growth. Higher light exposure or lower than the previous resulted in lower yields of carotenoids. An attempt to identify the type of carotenoids present was performed through further HPLC analysis of the different extracts. Only astaxanthin and lutein were identified, and these two pigments corresponded only to a percentage of 37 - 52% of the total carotenoids extracted. This set of assays showed that carotenoid production increased through time in all light conditions, and as so, this is an important factor for this production. A supplementary assay using a stable value of 3000 lux without photoperiod was performed and resulted in the highest yield obtained so far, 0.31%, by a Gordonia species. An evaluation of the cells physiology was made through flow cytometry analysis, considering that there is a set of studies describing the association between stress and carotenoid production. The results showed that the highest carotenoid producers (400 lux and 3000-7000 lux) were the ones with an overall higher population of stressed/dead cells (stressed:39-32% and dead: 8-12%), conversely, without light the healthy population was higher (81% instead of 49-60%), confirming this way the association between stress and carotenoid enhancement. Lastly, considering the described properties of carotenoids, antioxidant and antimicrobial assays were performed. The antimicrobial activity showed no positive results. On the other hand, in the antioxidant activity assay, the extract with higher activity (culture without light) achieved 3.4% of DPPH• (2,2-difenil-1-picril-hidrazilo) discoloration while the standard with similar concentration only had 1.8% of discoloration. Further testing should be performed using the purified pigments, since that in a crude extract other extractives may be present than pigments that can influence (positive or negatively) the overall properties of any bioactive compound present. In conclusion, these promising results point out for the exploitation of G. alkanivorans strain 1B as a possible hyper pigment-producer microorganism that may be applied towards different industries, since carotenoids are valuable bioactive molecules for chemical, pharmaceutical, food and cosmetic sectors. Additionally, since strain 1B is known by its great potential to desulfurize fossil fuels, the simultaneous exploitation of this high added value product produced by this microorganism may benefit a future scale-up of BDS, aiming to its further application downstream of a petroleum refinery towards ultra-low sulfur fuels, turning the overall BDS process more cost-effective