Comparative analysis of biomarker responses to environmental contamination in estuaries: a multi-taxa approach

Tese de mestrado, Ecologia Marinha, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2016Estuaries are highly productive areas of high ecological and economic importance, providing various benefits and services for mankind. The estuarine watershed is a preferential location for human settlement and associated anthropogenic activities, such as industrial and agricultural development, resource exploitation and shipping activities, which result in continuous pressures inevitably leading to environmental degradation. Biomarkers are considered early-warning signs able to provide a predictive perspective of the long-term effects of exposure to pollutants in organisms. Therefore, biomarkers are considered useful tools for environmental quality assessment that integrate biological responses and the degree of stressors, usually applied in a single taxa context. Exposure to xenobiotics compounds and their metabolites lead to enhanced oxidative stress and potentially to major molecular damages such as oxidation of proteins, DNA and peroxidation of unsaturated lipids in cell membranes. Hence, defence mechanisms play a major role in preventing damages and include several enzymes such as antioxidant enzymes superoxide dismutase enzymes (SOD) and catalase (CAT), as well as phase I ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) and phase II glutathione S-transferase (GST) biotransformation enzymes. Accordingly, these enzymes activities as well as both biomarkers of effects lipid peroxidation (LPO) and DNA damage (DNAd) were determined in the present study aiming at assessing overall contamination impacts on various organisms. In this context, the aim of this work is to quantify multiple biomarker responses in a multi-taxa approach, in order to assess the diversity in response patterns among species from two differently impacted estuarine systems. Two Portuguese estuaries, Tejo and Ria de Aveiro, were sampled in two months, June and September 2015, specifically in two sites in each estuary: Alcochete (ALC) and Vila Franca de Xira (VFX) in Tejo and Mira channel (AVSUL) and Murtosa (MUR) in Ria de Aveiro. Several species were selected based on their abundance and estuarine occurrence as well as on their prior use as bioindicator species. Two fish species were considered, the European sea bass Dicentrarchus labrax, a marine migrant species whose juveniles use estuarine areas as nursery areas; and the common goby Pomatoschistus microps a resident estuarine species. Four invertebrate species were also sampled, two common infaunal species, the bivalve Scrobicularia plana and the ragworm Hediste diversicolor and two epibenthic crustaceans, the brown shrimp Crangon crangon and the green shore crab Carcinus maenas. Overall, biomarker responses signaled environmental chemical exposure and some degree of deleterious effects for all species. Low variability among sites and months was observed in antioxidant enzymes responses for most species and no clear pattern was discernible amongst species. In fish species, induction of both biotransformation enzymes was observed with significant spatial variability, with lower variability of GST comparing to EROD activity, though with overall concordant higher levels in Tejo estuarine sites, especially in ALC. Less marked responses in biotransformation enzymes were observed in invertebrate species. A similar GST response pattern was observed for H. diversicolor, S. plana and C. maenas, identifying higher contamination levels in AVSUL, considered the least contaminated site in this study. Very low or even incipient spatial and temporal variability in EROD activity was observed in all invertebrates. Nevertheless, these species signaled mostly Tejo sites according to phase I enzyme responses, especially VFX, which is in agreement with previously reported environmental contamination levels. Concerning monthly variation in general all species showed higher enzyme activities and effects in September, which may reflect the effects of continuous exposure. Notwithstanding the significant activity of detoxification enzymes, deleterious effects were reported for all species, suggesting an overall contamination level above the capacity of the molecular defence mechanisms to limit exposure effects in these species. Biomarkers of effects response patterns differed amongst species, yet akin LPO variability patterns were observed among species, namely between C. crangon, C. maenas and P. microps, signalling VFX and for D. labrax, H. diversicolor and S. plana, signalling MUR. Most species also showed higher mean DNAd values in VFX, except for C. crangon and C. maenas that signalled MUR. A positive correlation between biomarkers of effects was observed for all invertebrate species (except for H. diversicolor), highlighting site-specific contamination. IBR indices also varied throughout sampled sites for all species studied, yet the major pattern observed was the opposed response pattern between a highly mobile fish species D. labrax and both infaunal invertebrate species (S. plana and H. diversicolor). Species-specific responses were evident from lack of concordance among species biomarker responses and IBR scores, most likely due to biological differences (in terms of physiology, vulnerability and overall capacity of defence mechanisms), but also to ecological differences such as differential habitat use, feeding habits, life-strategies and consequently differential contaminants exposure. Overall, Tejo sites were considered more impacted than Ria de Aveiro, yet significant responses were also found in the latter for all species studied. In conclusion, this multi-biomarker and multi-taxa approach provided important insights into the variability of species responses to contaminants exposure in estuaries. The complexity of biomarker response patterns for all species in this study evidenced species differential response and differential exposure to environmental contamination, on top of the complex environmental stimuli, such as pollutants’ mixtures and natural variability characteristic of the estuarine environment. This emphasizes the difficulties associated with effective multi-species ecological risk assessment, and application must carefully consider the potential added ecological value of a multispecific approach (similar to a multi-biomarker approach) versus more complex results interpretation and assessment of the environmental quality.Os estuários são sistemas de elevada importância ecológica onde, por exemplo, muitas espécies encontram as condições favoráveis à sobrevivência e rápido desenvolvimento, bem como de elevado potencial económico, constituindo uma fonte importante de recursos e serviços para o Homem. Consequentemente, estes sistemas tornam-se locais preferenciais para o desenvolvimento de centros urbanos, de que resultam inúmeras pressões associadas às atividades antropogénicas, desde a pesca, aquacultura, à indústria, agricultura e navegação, o que inevitavelmente conduz à degradação da qualidade ambiental. Os biomarcadores são frequentemente utilizados com o intuito de avaliar de que forma as pressões nestes sistemas afetam os organismos que os habitam. Constituem desta forma uma ferramenta útil em estudos de avaliação da qualidade ambiental, ao fornecerem uma perspetiva integrada da pressão existente e das respostas ao nível biológico. A exposição dos organismos a compostos xenobióticos resulta no aumento do stress oxidativo que propicia a ocorrência de danos ao nível da célula, nomeadamente a oxidação de proteínas e do DNA (DNAd) e peroxidação lipídica (LPO). Não obstante, os mecanismos de defesa das células desempenham um papel fundamental na prevenção desses efeitos, de que são exemplos: enzimas antioxidantes, como a catalase (CAT) e a superóxido dismutase (SOD), e de biotransformação, como a 7-etoxiresorufina-O-deetilase (EROD) e a glutationa-S-transferase (GST). O objetivo deste trabalho consiste no estudo comparativo das respostas biológicas de várias espécies às pressões antropogénicas a que estão sujeitas no seu ambiente natural, através da quantificação de diferentes biomarcadores, em estuários com níveis de pressões distintos, o estuário do Tejo e a Ria de Aveiro. A amostragem foi realizada em dois meses, em junho e em setembro de 2015, e em dois locais em cada estuário: Alcochete (ALC) e Vila Franca de Xira (VFX) no estuário do Tejo e o canal de Mira (AVSUL) e Murtosa (MUR) na Ria de Aveiro, cujo nível de contaminação, fontes de pressão, função de viveiro e abundância de espécies foi previamente descrito. Para tal, foram selecionadas várias espécies que utilizam ambos os estuários e consideradas, em trabalhos anteriores, bioindicadoras da qualidade ambiental, nomeadamente: duas espécies de peixes, o robalo-legítimo Dicentrarchus labrax e o caboz-comum Pomatoschistus microps, e quatro espécies de invertebrados, nomeadamente duas espécies endobentónicas, o poliqueta Hediste diversicolor e o bivalve Scrobicularia plana, e duas espécies de crustáceos epibentónicos, o camarão-mouro Crangon crangon e o caranguejo-verde Carcinus maenas. As atividades das enzimas SOD, CAT, EROD e GST bem como os níveis de LPO e DNAd foram analisados nos tecidos apropriados para cada uma das espécies consideradas. De um modo geral, as respostas dos biomarcadores evidenciaram a exposição a contaminantes no ambiente, passível de induzir alguns mecanismos de defesa e destoxificação e de produzir efeitos ao nível molecular em todas as espécies estudadas. A atividade das enzimas antioxidantes apresentou reduzida variabilidade entre locais e meses e não se observou nenhum padrão específico entre todas as espécies. As enzimas de biotransformação apresentaram maior variabilidade espacial e temporal que as antioxidantes, e maior nos peixes do que nos invertebrados. Os efeitos a nível molecular também foram evidentes, em todas as espécies, evidenciando um nível de contaminação global considerável que ultrapassa a capacidade de defesa e metabolização de xenobióticos destas espécies. Na generalidade, as respostas dos biomarcadores sinalizaram maiores níveis de contaminação nos locais do estuário do Tejo, assim como uma tendência de respostas mais elevadas em setembro, entre todas as espécies, quer para as enzimas antioxidantes e de biotransformação como para os biomarcadores de efeitos, possivelmente evidenciando um efeito de exposição continuada a stresses ambientais. De um modo geral, as respostas biológicas bem como os valores obtidos através do índice de IBR variaram bastante entre espécies e de acordo com os locais amostrados, tendo no entanto sido possível observar alguns padrões de resposta semelhantes entre espécies, particularmente no que diz respeito ao uso do habitat. Além disso, apesar dos locais do estuário do Tejo serem considerados mais impactados que os locais da Ria de Aveiro, nestes foram igualmente observados respostas significativas em várias espécies. A complexidade dos padrões de resposta dos vários biomarcadores analisados evidencia diferenças entre espécies em termos da sua fisiologia, vulnerabilidade aos contaminantes e capacidades dos mecanismos de defesa, bem como ao nível da ecologia, como o uso do habitat, e hábitos alimentares de que naturalmente decorrem diferentes níveis de exposição. A aplicação de uma abordagem multiespecífica e de vários biomarcadores pode constituir uma ferramenta útil para a compreensão de diferentes vias de exposição e para uma análise mais completa dos efeitos em diferentes componentes biológicos do ecossistema. No entanto, apesar de pertinente a nível ecológico, é evidente a complexidade de interpretação que lhe está associada, e para a qual a aplicação em programas de monitorização e de avaliação da qualidade ambiental requer maior planeamento. Além disso, a seleção das espécies deverá ser ponderada de acordo com o objetivo do estudo, sendo que diferentes espécies irão gerar avaliações de impacto diferentes para os mesmos locais