Dynamics of circulating coelomocytes during starfish regeneration

Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2016A regeneração é um fenómeno regulado com implicações biológicas variadas. No Reino Animal, há diversos exemplos deste processo que envolvem a reparação de tecidos, órgãos e membros. No entanto, a regeneração nos vertebrados é limitada na medida em que não se observa a regeneração completa de todos os órgãos. Nos invertebrados, existe uma maior flexibilidade em termos de reparação e até mesmo de substituição de tecidos e/ou órgãos. Após predação ou autotomia, alguns animais são capazes de substituir o órgão ou a porção perdida e muitas vezes esta pode levar uma vida autónoma podendo ela própria regenerar e até formar um individuo completo, dependendo sempre da perda, mas também da capacidade de regeneração do organismo. Este fenómeno acaba por se sobrepor nos invertebrados com a reprodução assexuada. Muitos equinodermes têm uma capacidade regenerativa elevada que se mantém ao longo de toda a sua vida, incluindo na fase adulta. A primeira resposta na regeneração é o fecho das feridas pelas contrações musculares e a formação de agregados de celómocitos, as células circulantes do fluído celómico que banha toda a cavidade interna dos equinodermes. Estas células têm um papel reconhecido na primeira linha de defesa do sistema imunitário que inclui várias funções, como coagulação e defesa contra organismos patogénicos por fagocitose. Os equinodermes têm uma grande proximidade filogenética com os cordados. Contudo o estudo destes organismos ao nível molecular não é muito frequente. Devido à pouca informação relativamente ao seu genoma, transcriptoma, proteoma ou metaboloma e por haver outros organismos com mais informação reportada, estes facilitam as comparações extrapoladas com cordados. Embora o ouriço do mar Strongylcentrotus purpuratus seja o único equinoderme a ter o genoma sequenciado e anotado, e consequentemente vários estudos moleculares tenham sido possíveis, estes organismos têm a menor capacidade de regeneração observada entre as diferentes classes de equinodermes, tendo sido muito reduzida a sua contribuição para o estudo da regeneração. Para uma maior compreensão dos coelomócitos, este trabalho apresenta a caracterização das populações celulares e a sua variância percentual durante o processo de regeneração. Embora a classe Asteroidea não tenha sido utilizada extensamente, os organismos desta são uma excelente escolha para o estudo do processo da regeneração. Marthasterias glacialis L. é uma estrela do mar espinhosa, betónica que pode ser encontrada ao longo de toda a costa oeste portuguesa capaz de viver a vários níveis de profundidade (0–200m), podendo atingir até 70 centímetros de diâmetro e com capacidade de regenerar todas as partes do corpo (internas e externas), incluindo o sistema nervoso central. Devido ao facto de haver pouca informação relativa aos equinodermes e mais especificamente às estrelas do mar, é por vezes difícil encontrar correlações na literatura com o estudo aqui apresentado. Efetuar analogias com outras classes de equinodermes é também desafiante, devido às diferenças inter-espécie, na metodologia escolhida para o estudo das células (diferentes tipos de microscopia) ou até no manuseamento dos celomócitos (células vivas ou fixadas, ex vivo ou em cultura). Desta forma, a primeira fase deste estudo foi dedicada à caracterização das populações celulares do fluído celómico através da citometria de fluxo e por microscopia de fluorescência. De forma a prosseguir com a caracterização do fluído celómico, algumas etapas de otimização tiveram de ser efetuadas para que o manuseamento das células ex vivo se fizesse sem comprometer o estudo ou os seus objetivos. Estas otimizações foram feitas ao nível das condições que reduzissem a agregação dos celomócitos após recolha do fluído celómico com o uso de diferentes tampões anticoagulantes, de diferentes condições de centrifugação, de diversas concentrações de corantes para que a análise de diferentes estudos (viabilidade celular e ciclo celular) fosse possível. Iii O desafio da optimização do ensaio de viabilidade celular centrou-se na escolha de dois corantes compatíveis, ou seja, que apresentassem comprimentos de onda de emissão e locais de ligação ao DNA distintos para que a análise fosse mais fiável. Duas populações celulares no fluído celómico (aqui designadas como P3 e P5) foram distinguidas através da citometria de fluxo e analisadas individualmente em termos de abundância no fluído celómico, morfologia, viabilidade celular e ciclo celular. A células da população P3 são as menos abundantes no fluído celómico, têm uma forma arredondada com um diâmetro nunca superior a 4 μm. Quanto à sua caracterização ao nível da viabilidade celular estas incorporam os diferentes corantes de exclusão de viabilidade celular após a recolha do fluído celómico, indicando uma baixa ou até nenhuma viabilidade celular. A população celular P5, que é regularmente 4 vezes mais numerosa que a população P3, apresenta várias morfologias, dependendo da concentração salina do meio ou do substrato que contactam, assim o seu tamanho varia entre 7 μm a 23 μm. Estas têm uma alta viabilidade celular no momento em que abandonam o organismo, observada pela não incorporação dos corantes de exclusão. A sua viabilidade vai diminuindo ao longo do dia da experiência mesmo em condições de escuridão e baixa temperatura (4ºC). As diferentes fases do ciclo celular variam na quantidade de DNA em cada célula (a fase G2M tem o dobro do conteúdo de DNA da fase G0G1). Para o estudo do ciclo celular, a concentração do corante (iodeto de propídeo) tem de ser saturante para que se possa inferir em que fase do ciclo as células se encontram. Para as células P3 não foi possível detectar eventos para todas as fases do ciclo celular, podendo ser devido à falta de viabilidade que apresentam, tendo uma atividade metabólica ou mitótica reduzida. As células P5 apresentam um ciclo celular bem definido, no qual a maioria das células se encontra na primeira fase do mesmo. Devido ao aparecimento de gâmetas masculinos, em algumas amostras de fluído celómico, a sua caracterização morfológica e análise citométrica foi também possível. Os estudos feitos até ao momento envolvendo celomócitos da espécie M. glacialis centraram-se na caracterização do seu proteoma total, sem separação das diferentes populações, e na proteómica diferencial nas diferentes fases da regeneração. Para isso a caracterização do proteoma de cada população, isolada por citometria de fluxo seria o próximo passo. Contudo houve algumas dificuldades na recuperação das células após a sua separação por citometria de fluxo. Sendo este processo provavelmente violento física e osmoticamente para as células. A reprodutibilidade da técnica para estes tipos celulares foi muito baixa, devido à disparidade dos resultados nos diferentes ensaios. O estudo da proteómica diferencial foi feito para pontos temporais que cobrissem as diferentes fases da regeneração (48 horas, 13 dias e 10 semanas). A maioria dos estudos feitos em celomócitos durante a regeneração sugere que o seu papel é mais determinante na primeira fase do processo regenerativo – cicatrização. Assim optou-se pelo estudo dos celomócitos durante o primeiro dia de regeneração. Algumas diferenças estatisticamente significativas foram observadas nas percentagens de células P5 nas primeiras horas (2, 8 e 24 horas) após amputação comparando com os valores relativos a um grupo controlo. Antes da indução da regeneração (t=0), a população P5 no grupo de animais posteriormente amputados apresenta uma média de valores percentuais superior à do grupo controlo. Após indução da regeneração, as proporções da população P5 diminuem significativamente. Os principais fatores a contribuírem para esta perda de células será a perda de fluido celómico através das feridas e o seu recrutamento para o processo de coagulação. A variação da proporção da população P3 ao longo do tempo mostrou ser independente do processo de regeneração. Os gâmetas masculinos apareceram durante o estudo dos celomócitos na regeneração apenas nos indivíduos que foram amputados. A caracterização das populações de celomócitos apresentada nesta dissertação constitui um contributo para o conhecimento das funções fisiológicas dos celomócitos circulantes desta espécie de equinoderme.Regeneration is a phenomenon that occurs throughout the Animal Kingdom and it has wide biological implications. Echinoderms have an outstanding regeneration ability that allows the replacement and regrowth of lost organs or body parts due to injury caused by autotomy or predation. The first response in the regeneration process is to close all the wounds with muscle contraction and coelomocytes clots. Coelomocytes are free circulating cells in coelomic fluid, which fills the internal cavity of echinoderms. These cells are known to have a role in the first defence by the immune system, with different functions as clotting, and defence against pathogens such as phagocytosis. Starfishes are excellent organisms to explore organ and tissue regeneration. Marthasterias glacialis L. belongs to Asteroidea class and it has whole body regeneration ability, including the central nervous system. Due to a lack of knowledge, it is difficult to find information about coelomocytes characteristics or to compare it with other classes of echinoderms, due to interspecies variability and to the diverse methodical approaches used in the several published studies. Thus the first part of this study was to characterize different coelomocytes population through flow cytometry and fluorescence microscopy. In order to perform coelomic fluid cells characterization, several optimization steps had to be done so as to know how to handle these cells ex vivo. Two different populations (here named P3 and P5) were found among coelomocytes and they were studied individually in terms of abundance, morphology, cell viability and cell cycle. P5 showed to have morphological similarities with phagocytes population whereas P3 cell populations seemed to have low metabolic or mitotic activity. Due to male gametes appearance in coelomic fluid samples, its characterization through flow cytometry was possible. Coelomocytes dynamics during regeneration was also assessed during the first day after amputation. There were a few statistically significant differences only in P5 cell population percentage in the first hours (2h, 8h and 24h) after amputation when compared with values for non-amputated animals. The work presented in this dissertation will hopefully contribute to an increase on the available cellular and molecular knowledge about circulating coelomocytes in M. glacialis