3D visualization of tissue specific vascular patterns for endothelial cell polarity analysis

Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016A formação de uma rede vascular funcional e padronizada e crucial para o desenvolvimento e crescimento de todos os vertebrados. Qualquer disfunção na formação da rede vascular leva a patogénese de varias doenças como tumores, malformações arteriovenosas, aneurismas, entre outros. Apos a vasculogénese (formação de vasos a partir de precursores endoteliais), a angiogénese expande e remodela a vasculatura. Esta remodelação e um balanco entre sprouting e regressão de vasos que determina uma rede vascular hierárquica e funcional. Estudos recentes apontam para um papel importante da motilidade e polaridade das células endoteliais no processo de morfogénese vascular. A polaridade celular consiste na distribuição assimétrica de proteínas e organelos dentro da célula, que permite definir estruturas e funções específicas em diferentes regiões da mesma célula. A distribuição assimétrica e estabelecida por complexos de proteínas que definem o eixo de polarização a jusante de factores extracelulares. As células podem estar polarizadas em vários eixos, como o eixo apico-basal ou anterior-posterior/axial. Franco et al. definiram o posicionamento do Golgi em relação ao núcleo como eixo de polaridade axial nas células endoteliais. O VEGF e o fluxo sanguíneo são dois reguladores importantes da polaridade axial das células endoteliais. O fluxo sanguíneo e importante para a padronização/remodelação da rede de vasculatura. Esta remodelação e o que leva a aquisição de padrões vasculares específicos em cada tecido. Este padrão/arquitetura de vasos e importante e bastante distinto entre órgãos, pois correlaciona-se com a função do tecido e a importância da circulação para essa função. As células endoteliais têm capacidade de sentir a fricção causada pelo fluxo sanguíneo, chamada de tensão de cisalhamento, traduzindo forca em sinais bioquímicos mediante varias moléculas, incluindo PECAM1, VE-caderina, VEGFR2, PIEZO1 e cílios primários. O fluxo induz a polarização das células na direcção contraria a do fluxo. Já o VEGF, um factor pro-angiogénico, induz também polarização das células endoteliais em direção a gradientes crescentes de VEGF. Notavelmente, durante o processo de angiogénese, a polarização induzida por estes dois factores e tendencialmente oposta. Com base nestas observações, formulamos a hipótese de que o VEGF e o fluxo sanguíneo estão em competição para estabelecer o eixo de polaridade das células endoteliais. Esta competição terá assim um impacto na orientação das células endoteliais, e consequentemente na morfogénese vascular e padronização. Esta questão tem ainda especial interesse pois sabe-se também que diferentes órgãos possuem níveis variados de VEGF, o que também e correlacionado com padrões vasculares próprios. Assim, o nível da competição entre o VEGF e o fluxo sanguíneo poderá ter um papel importante na definição dos padrões vasculares específicos a cada órgão. Sabe-se que o complexo PAR (PAR-6/PAR-3/aPKC) define o eixo de polaridade de vários tipos celulares. Resultados preliminares mostram que este complexo regula a capacidade das células polarizarem em reação ao VEGF e ao fluxo sanguíneo. Desconhece-se, no entanto, as vias de sinalização que estabelecem a competição entre estes dois factores de polarização. No estudo realizado pretendemos responder a duas questões: como decorre a remodelação de vasos em cada órgão que leva a uma arquitetura vascular especifica? Terá o VEGF influência na polarização das células endoteliais contra o fluxo e essa influência alterna o padrão da vasculatura? Para tentar responder a estas questões, técnicas de imagiologia foram usadas para determinar a polaridade das células endoteliais e morfologia da vasculatura em cada órgão, usando técnicas de visualização 3D e métodos que permitem aumentar a transparência dos tecidos. A transparentização consiste em diminuir a dispersão de luz que ocorre nos tecidos, o que os torna opacos, de modo a igualar os índices de refração do meio com o índice de refração médio do tecido. As técnicas dividem-se em dois grandes grupos: técnicas que utilizam solventes orgânicos e técnicas aquosas. Dentro destes grupos, os métodos para obter tecidos transparentes consistem em imersão simples dos tecidos para igualar os índices de refração ou remoção de lípidos. Neste âmbito varias técnicas de transparentização foram testadas e otimizadas na tentativa de compatibilizar a marcação com fluorescência das estruturas com a técnica aplicada. Os primeiros testes revelaram sensibilidade da marcação dos vasos com anticorpos que marcavam receptores de membrana. Estas técnicas removiam lípidos pelo que se justificava a ausência de marcação, sendo que algumas destas foram excluídas. A técnica que melhor conciliou a capacidade de transparentização e com a compatibilidade com a marcação com anticorpos (isto apos algumas modificações ao protocolo original) foi a técnica designada Protocolo 2 que foi uma adaptação do protocolo CUBIC. Apos a otimização das técnicas e da marcação com anticorpos específicos que se estavam a utilizar, procedeu-se a adição do anticorpo para marcar o complexo de Golgi ao cocktail de anticorpos. A dificuldade na marcação do complexo de Golgi e do núcleo residiu na reação cruzada que havia nos anticorpos secundários, uma vez que os primários foram criados na mesma espécie. A visualização das três entidades era compatível com o protocolo de transparentização que se estava a utilizar, mas as imagens obtidas podem ser muito confusas devido a presença de sinal de golgi em dois canais. No entanto o tamanho dos dois organelos e distinto, permitindo a diferenciação entre os dois. Durante a otimização do protocolo, foram feitos testes ao sistema de microscópio de lightsheet que seria o microscópio especializado para obter grandes imagens tridimensionais sem ter de haver seccionamento físico das amostras. Este microscópio contem uma camara onde fica suspensa a amostra mergulhada num líquido de índice de refração compatível com o índice médio da amostra apos ser transparentizada. Testes iniciais usando retinas de ratinho revelaram a dificuldade em trabalhar com ficheiros obtidos neste sistema, uma vez que uma aquisição de uma retina inteira daria origem a um ficheiro de 1Tb, praticamente impossível de processar nas estacoes de trabalho presentes no instituto. Apos alguns testes, passou-se para aquisição de órgãos. Notoriamente a aquisição da vasculatura do cérebro teve sucesso. O cérebro e facilmente transparentizado e a vasculatura e bastante fácil de adquirir em lightsheet. Para fazer reconstrução 3D da vasculatura usando lightsheet, o cérebro e um bom candidato. Já o rim, não transparentiza tao facilmente como o cérebro e a vasculatura e altamente densa, sendo que o lightsheet não e capaz de resolver a estrutura típica do rim que e o glomérulo. Possivelmente o rim terá de ser adquirido em confocal, mas este microscópio tem uma distancia de trabalho limitada não permitindo adquirir grandes estruturas em 3D. O intestino tem a estrutura especializada da vilosidade que e facilmente adquirida em confocal. Com a imunofluorescência do complexo de Golgi e do núcleo obtida, trocam-se os vectores de polaridade das células utilizando um script do MatLab escrito especificamente para desenhar vetores de polaridade. Porem o script funciona bem assumindo que a rede vascular e bidimensional, como nas retinas, o que não acontece em órgãos uma vez estes apresentam uma rede vascular tridimensional complexa. Do mesmo modo, simular o fluxo também se torna complicado para estas estruturas. Como tal não se pode correlacionar a polaridade com o fluxo sanguíneo, nem correlacionar com VEGF. A adaptação de um protocolo de transparentização compatível com as marcações para os vasos, núcleos e complexo de Golgi foi um passo essencial para se poder visualizar órgãos e traçar vetores de polaridade, para futuramente se poder tirar resultados mais conclusivos em relação a orientação das células em relação ao fluxo e a influência do VEGF para a mesma polarização e potencialmente para a padronização dos vasos específica de cada órgão.Tissues require specialised vascular beds to perform their functions. The main mechanisms driving organ-specific vascular remodelling are poorly understood. VEGF is the main regulator of sprouting angiogenesis, inducing the expansion of the primitive plexus into a highly branched network. Shearstress, on the other hand, is the remodelling inducer, that is very important for patterning. VEGFdriven angiogenesis generates a highly branched network where some vessels are not well perfused. During the remodelling and maturation of the angiogenic network, vessel regression eliminates superfluous vessels. Thus, through vascular remodelling the network becomes hierarchically organized and functional. It is known that different tissues have different VEGF distribution patterns and different haemodynamic specificities. Given that both VEGF and shear stress are endothelial cell polarity inducers, we propose that these two factors compete for establishing the endothelial cell polarity axis and that this competition may influence organ-specific patterning. To be able to tackle this question, we decided to develop methods to visualize vascular patterns of whole-organs, stained not just for vessels, but for endothelial cell nucleus and Golgi apparatus as well, in order to assess the endothelial cell polarity and correlate it with VEGF levels in those tissues. In order to visualize deep into tissue we had to optically clear the different tissues (make them transparent). Most of the clearing protocols damage immunofluorescence stainings, so we focused on achieving a clearing protocol that would clear the tissue well while maintaining staining integrity, enabling us to make 3D image acquisition for polarity analysis. For large 3D imaging, the lightsheet microscope was used, for it is a system designed to allow imaging of whole cleared organs. Polarity analysis and correlation with flow and VEGF was not possible, since 3D networks were harder to analyze, but a successful clearing protocol for the specific polarity staining was achieved