Determinação de compostos bioativos e atividades biológicas, de extratos aquosos de folhas de Actinidia deliciosa

Tese de mestrado em Química, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016Na agricultura a poda de árvores e arbustos origina uma grande quantidade de detritos, que não são, na grande maioria das vezes, utilizados de forma mais eficiente pela indústria. Muitos destes detritos, principalmente as folhas, são ricas em compostos fenólicos, os quais conferem à planta proteção contra, a radiação ultravioleta e o ataque por agentes patogénicos, mas além disso são compostos que apresentam atividades biológicas muito interessantes, para a saúde humana e animal, como antioxidante, anti-inflamatória, entre outras. A poda da Actinidia deliciosa decorre durante o mês de dezembro e deste processo resultam enormíssimas quantidades de folhas que são, hoje em dia, desvalorizadas pela indústria. Um dos objetivos deste trabalho passou por caracterizar extratos das folhas de Actinidia deliciosa. No entanto, a caracterização do extrato de Actinidia deliciosa não foi desenvolvido somente para folhas recolhidas durante a poda, em dezembro, mas também para folhas de Actinidia deliciosa recolhidas em diferentes estágios de desenvolvimento. Inicialmente através de um processo de decocção, foram preparados extratos aquosos de folhas da Actinidia deliciosa, recolhidas em diferentes períodos de desenvolvimento, entre os quais, no aparecimento das primeiras folhas (abril de 2014), na frutificação (setembro a novembro de 2015) e no período de poda da planta (dezembro de 2015). Para os diferentes extratos de Actinidia deliciosa, foram quantificados os seus conteúdos em fenóis totais, taninos, açúcares redutores, proteínas e mucilagem. O extrato de dezembro de Actinidia deliciosa foi o que revelou maior conteúdo em fenóis totais, taninos e proteínas. O extrato de abril foi o que demonstrou maior conteúdo em mucilagem e o extrato de novembro em açúcares redutores. Para tentar obter um extrato mais concentrado em compostos fenólicos, foram aplicados diferentes métodos de purificação, usando cromatografia de fase reversa (extração em fase sólida, SPE, e recolha de frações por HPLC) e precipitação de mucilagens com etanol. Estes métodos foram aplicados com o intuito de eliminar interferentes, presentes na matriz e com isso concentrar os compostos fenólicos por miligrama de extrato. Para cada método foi determinado o conteúdo em fenóis totais, taninos e avaliada a atividade antioxidante de cada uma das frações fenólicas resultantes. Dos três métodos, a precipitação de mucilagens com etanol, foi o que demonstrou melhores resultados, mostrando ser um método muito promissor, já que ao contrário dos outros dois métodos, é mais económico e permite tratar grandes volumes de amostra. As mucilagens resultantes da precipitação com etanol foram analisadas por FTIR A identificação de compostos bioativos por HPLC e LC-MSn, dos extratos aquosos de Actinidia deliciosa, revelou a presença de derivados de quercetina, proantocianidinas (B e C), ácido quínico, miricitrina, e ácido triterpénico-O-hexósido. O conteúdo em rutina e quercitrina (derivados de quercetina) foi quantificado para os vários extratos de Actinidia deliciosa. As atividades biológicas foram desenvolvidas para o extrato de dezembro (extrato com maior conteúdo em compostos fenólicos) e para a fração fenólica resultante da precipitação das mucilagens. Foram avaliadas as atividades antioxidantes e anti-acetilcolinesterase, e os resultados adquiridos revelaram ser muito promissores, com valores de IC50 e EC50 baixos, para a inibição da enzima acetilcolinesterase (794 μg/mL e 567 μg/mL, para o extrato e fração purificada, respetivamente), e para a atividade antioxidante, quer no sequestro de radicais livres (DPPH: 12,8 μg/mL e 9,4 μg/mL, para o extrato e fração purificada, respetivamente; radicais de óxido nítrico: 449,4 μg/mL e 81 μg/mL, para o extrato e fração purificada, respetivamente) quer na inibição da peroxidação lipídica (330,8 μg/mL e 152,5 μg/mL, para o extrato e fração purificada, respetivamente). Para os ensaios em linhas celulares Caco-2 foram analisadas duas amostras: o extrato de Actinidia deliciosa e a fração fenólica resultante da precipitação das mucilagens. Os ensaios em Caco-2 permitiram avaliar a citotoxicidade, das amostras e a permeação da rutina e quercitrina, nas células do intestino. Os resultados demostraram que, tanto o extrato de Actinidia deliciosa, como a fração fenólica não são citotóxicos, e a permeação da rutina e da quercitrina, apresentaram valores satisfatórios, no entanto a permeação da rutina e quercitrina foi relativamente maior no extrato (10 % e 5 %, para o extrato e fração purificada, respetivamente), demonstrando que a presença de mucilagens poderá ter um papel importante na permeação destes compostos. Foi também desenvolvida uma análise eletroforética para avaliar, até que ponto a presença de mucilagens no extrato influenciaria a expressão proteica no citosol das células, após o processo de permeação. Os resultados revelaram que, as células que estiveram em contato com a fração fenólica (sem mucilagens) viram a sua expressão proteica alterada. Os resultados adquiridos ao longo deste trabalho revelam que, as folhas resultantes da poda de Actinidia deliciosa podem ser aproveitadas pela indústria farmacêutica/alimentar como fonte de compostos bioativos.Pruning trees and shrubs in agriculture results in a large amount of debris, which are not, in most cases, used more efficiently by the industry. Many of these debris, especially the leaves, are rich in phenolic compounds, which give the plant protection against ultraviolet radiation and action of pathogens. Additionally, these phenolic compounds exhibit very interesting biological activities, for human and animal health, such as antioxidant anti-inflammatory, among others. By their inherent biological activity, they can be applied in several areas. The pruning of Actinidia deliciosa takes place during the month of December, and this process produces huge amounts of leaves that are devalued by the industry. One of the objectives of this study, underwent characterize extracts from Actinidia deliciosa leaves. However, the characterization of Actinidia deliciosa extract was not developed only for leaves collected during pruning in December, but also Actinidia deliciosa leaves collected at different stages of development. Initially through a decoction process, were prepared aqueous extracts of Actinidia deliciosa leaves, collected at different stages of development, including in the appearance of the first leaves (April 2014), the fruiting (September to November 2015) and in plant pruning period (December 2015). For different Actinidia deliciosa extracts its contents were quantified in total phenols, tannins, reducing sugars, proteins and mucilage. The December, Actinidia deliciosa extract had the highest content in total phenols, tannins and proteins. The extract of April showed higher content in mucilage and November extract in reducing sugars. To try to get a more concentrated extract in phenolics purification methods were applied, using reverse phase chromatography (solid phase extraction, SPE, and collecting fractions by HPLC) and mucilage’s precipitation with ethanol. These methods have been applied to eliminate interferences that may be present in the matrix, and thereby concentrate phenolic per milligram of extract. For each method, the content in total phenols and tannins was determined, and the antioxidant activity of each of the resulting phenolic fractions was evaluated. Of the three methods, mucilage precipitation with ethanol, demonstrated the best results, showing to be a very promising method, since unlike the other two methods, this is more economical and allows large volumes of sample to be handled. The mucilage of the resulting ethanol precipitation was analyzed by FTIR. The identification of bioactive compounds by HPLC and LC-MSn, of Actinidia deliciosa aqueous extracts, revealed the presence of derivatives of quercetin, proanthocyanidins (B and C), quinic acid, myricitrin and triterpen-O-hexoside acid. The content of quercetin and rutin (quercetin derivatives) were quantified for different Actinidia deliciosa extracts. The biological activities have been developed to extract December (extract with a higher content of phenolics), and the resulting phenolic fraction of mucilage precipitation. The antioxidant activities and anti-acetylcholinesterase were evaluated, the results obtained was very promising, for antiacetylcholinesterase activity (794 μg/mL and 567 μg/mL, before and after purification, respectively), antioxidant activity as radical scavenger (DPPH: 12.8 μg/mL and 9.4 μg/mL, before and after purification, respectively; nitric oxide radicals: 449.4 μg/mL and 81 μg/mL, before and after purification, respectively) and preventing lipid peroxidation (330.8 μg/mL and 152.5 μg/mL, before and after purification, respectively). For assays in cell lines Caco-2 two samples were analyzed: The Actinidia deliciosa extract and the resulting phenolic fraction of mucilage precipitation. The Caco-2 assays allows to evaluate the cytotoxicity of the samples, and the permeation of quercitrin and rutin in the intestinal cells. The results showed that both, Actinidia deliciosa extract, and phenolic fraction are not cytotoxic, and the permeation of rutin and quercitrin showed satisfactory values, when compared with the literature, however the permeation of rutin and quercitrin in the extract was relatively higher (10 % and 5 %, before and after purification, respectively), showing that the presence of mucilage in the extract can help permeation of rutin and quercitrin. The electrophoretic analysis, was also developed for understanding how the presence of mucilage in the extract, can influence the protein expression in the cytosol of the cell, after the process of permeation. The results revealed that protein expression, from cells that were in contact with the phenolic fraction (without mucilage) has changed. The results obtained during this work show that the leaves resulting from Actinidia deliciosa pruning, can be used by the pharmaceutical/food industry as a source of bioactive compounds