Iron man(ipulation): unravelling the iron responsive genes' network in malaria parasites

Tese de mestrado em Bioinformática e Biologia Computacional, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016A Malária é uma doença infeciosa causada por várias espécies de parasitas protozoários do género Plasmodium. Entre eles, P. falciparum é o que provoca a maior mortalidade em humanos. O parasita apresenta um ciclo de vida complexo, alternando entre o inseto vetor que transmite a forma infeciosa do parasita e o hospedeiro mamífero, no qual após a infeção o parasita passa por uma enorme replicação causando os sintomas da doença. Após a picada de um mosquito infetado, formas móveis denominadas esporozoítos são injetadas dentro do hospedeiro mamífero e viajam até ao fígado onde invadem hepatócitos. Após replicar dentro dos hepatócitos, milhares de novos parasitas são libertados para a corrente sanguínea onde invadem os glóbulos vermelhos. Durante a fase sanguínea da infeção o parasita passa por diversas formas de desenvolvimento, utilizando um programa de expressão génica altamente coordenado onde genes codificantes de proteínas para funções específicas de cada forma são ativados apenas quando são necessários. Ocasionalmente, algumas formas da fase sanguínea diferenciam-se em gametócitos, a forma sexual transmissível para os mosquitos. Durante este complexo ciclo de vida, para assegurar a sua sobrevivência e replicação, o parasita necessita de sequestrar nutrientes e micronutrientes de várias fontes dos tecidos do mosquito e do mamífero. Portanto, foi posta a hipótese de que os parasitas causadores de malária possuem mecanismos adequados de adaptação de maneira a possibilitar a utilização desta enorme variedade de recursos. O ferro é um dos micronutrientes mais importantes, estando envolvido em diversos processos celulares essenciais para a sobrevivência, como a replicação do ADN e a produção de ATP. Por outro lado, o ferro é altamente tóxico quando se encontra em excesso, o que implica que a sua concentração dentro das células tenha que ser mantida num intervalo restrito. Isto é tipicamente alcançado através da regulação da expressão de proteínas envolvidas na aquisição de ferro, armazenamento e metabolismo. Apesar do papel fundamental do ferro e da sua regulação para a sobrevivência celular, uma grande quantidade de informação básica encontra-se em falta no que diz respeito à forma como o parasita lida com este valioso recurso. De maneira a abordar esta questão, realizámos uma análise do transcriptoma total de P. falciparum durante a fase sanguínea em condições a curto prazo de privação de ferro e exposição a excesso de ferro. Ao identificar os genes diferencialmente expressos entre as diferentes condições e os respetivos controlos, pretendemos encontrar genes envolvidos na deteção e regulação de ferro. Os genes identificados como diferencialmente expressos possuem uma grande variedade de funções, desde fatores de transcrição e proteínas de ligação a ARN mensageiro até componentes do sistema ubiquitina-proteossoma, ARNs não codificantes, transferases de grupos metilo de histonas, vários transportadores e proteínas envolvidas no metabolismo. Estes resultados sugerem a existência de diversos níveis de regulação dos genes relacionados com o ferro, tanto ao nível da transcrição e da pós-transcrição, bem como ao nível da degradação de proteínas e mecanismos epigenéticos, indicando uma rede altamente complexa envolvida na manutenção da homeostasia do ferro em Plasmodium.Malaria is an infectious disease caused by several species of protozoan parasites of the Plasmodium genus. Among them, P. falciparum is the one causing the greatest mortality in humans. The parasite has a complex life-cycle, switching between the insect vector which transmits the infective form of the parasite and the mammalian host, in which upon infection parasite goes through enormous replication causing the symptoms of the disease. Upon the bite of an infected mosquito, motile forms called sporozoites are injected into the mammalian host which travel to the liver and invade hepatocytes. After replicating inside hepatocytes, thousands of new parasites are released into the bloodstream where they invade red blood cells. During the blood stage of the infection the parasite goes through several developmental stages, using a tightly coordinated gene expression program where genes encoding proteins for stage-specific functions are activated only when they are required. Occasionally, some blood stage forms differentiate into gametocytes, the sexual stage transmissible to the mosquitoes. During this complex life cycle, to support its survival and replication, parasite needs to scavenge nutrients and micronutrients from various sources of the mammalian and insect tissues. Thus, it is hypothesized that malaria parasites must have adequate mechanisms of adaptation to be able to use this wide range of resources. Iron is one of the most important micronutrients, as it is involved in several cellular processes essential for survival, such as DNA replication and ATP production. On the other hand, iron is highly toxic when found in excess, therefore its intracellular concentrations need to be kept in a very narrow range. This is typically achieved through regulation of expression of proteins involved in iron acquisition, storage and metabolic usage. Despite the critical role of iron and its regulation for cell survival, a great deal of basic information is missing regarding the way that malaria parasites deal with this valuable resource. In order to address this question, we performed genome-wide transcriptome analysis of P. falciparum blood-stage by RNA-seq in conditions of short-term iron deprivation and exposure to iron excess. By identifying the differentially expressed genes between the different conditions and the respective control, we aimed to find genes involved in iron sensing and regulation. The genes identified as differentially expressed had a great variety of functions, from transcription factors and mRNA-binding proteins to components of the ubiquitin-proteasomal system, ncRNAs, histone methyl-transferases, several transporters and metabolism-related proteins. These results suggest the existence of several layers of regulation of the iron-responsive genes, both at the levels of transcription and post-transcription, as well as protein degradation and epigenetic mechanisms, pointing to a highly complex network involved in the maintenance of iron homeostasis in Plasmodium