Design de bioimobilizados de Beta-galactosidase para aplicação à produção de leites funcionais

Tese de mestrado, Controlo de Qualidade e Toxicologia dos Alimentos, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2015Problema que afeta cerca de 75% da população mundial em geral, a intolerância à lactose, apresenta-se pela inaptidão do organismo degradar de forma total ou parcial a lactose, principal hidrato de carbono presente no leite e derivados, causando desta forma distúrbios gastrointestinais. Esta incapacidade na digestão do principal açúcar dos produtos lácteos é resultado do défice na enzima intestinal, β-galactosidase comumente conhecida por lactase, responsável pela hidrólise da lactose em galactose e glucose. Com importância biotecnológica para a indústria alimentar, a hidrólise enzimática da lactose permite assim dar resposta a este problema e as caraterísticas alimentares são conservadas ou aumentadas no seu valor nutricional. Com este trabalho pretendeu-se estudar a enzima β-galactosidase comercializada sob a forma livre, Lactozym 2600L® da Sigma-Aldrich® e na forma imobilizada SPRIN Imibond-galactosidase da SPRIN Tecnhologies®, ambas com origem no microrganismo Kluyveromyces lactis. A atividade enzimática e estabilidade operacional destas enzimas foi estudada à temperatura de 45ºC e pH 7 sob o substrato específico, 2-nitrofenil-β-D-galactopiranoside (ONPG), uma vez que o seu mecanismo de hidrólise é similar ao da lactose e nas matrizes alimentares, soro de queijo, leite UHT comercializado no hipermercado e leite de ovelha que não sofreu qualquer tratamento térmico. Além do estudo nas formas em que são comercializadas, foram também realizados ensaios com a enzima Lactozym 2600L imobilizada em esferas de alginato de cálcio e ensaios de magnetização utilizando o óxido ferro (II, III) da Sigma-Aldrich com a enzima SPRIN Imibond-galactosidase e as esferas de alginato de cálcio com a enzima livre imobilizada. Foram também realizados ensaios de alta pressão hidrostática com o substrato ONPG, a fim de verificar se as enzimas mantinham a sua atividade quando submetidas a pressões entre 50 e 200 MPa sob as temperaturas de 25, 45 e 65ºC. Pretendia-se também simular condições de pasteurização em matrizes alimentares mas por problemas operacionais não foi possível realizar estes ensaios. De todas as formas enzimáticas empregues nestes ensaios, foi a Lactozym 2600L na sua forma livre e em seguida imobilizada em esferas de alginato de cálcio que apresentou os melhores resultados. No final do trabalho foram ainda realizados ensaios microbiológicos para verificar a ação antimicrobiana do alginato cálcio no leite de ovelha não tratado, através da pesquisa de microrganismos totais a 30ºC e enterobactérias, baseados na ISO 4833-2 e 21528-2.Problem affecting around 75% of the world population, lactose intolerance shows itself by the inability of the organism degrading in a total or partial way the lactose, main carbon hydrate in the milk and derivatives, causing like this gastro-intestinal disturbances. This inability in digesting the main sugar in the dairy products it’s the result of a deficit in the intestinal enzyme, β-galactosidase, commonly known as lactase, responsible for the lactose hydrolysis in galactose and glucose. With biotechnological importance to the food industry, the lactose enzymatic hydrolysis allows to response to this problem and the food characteristics are conserved or increased in their nutritional value. With this report the aim is to study the β-galactosidase enzyme commercialized in a free shape, Lactozym 2600L® da Sigma-Aldrich® and in the immobilized way SPRIN Imibond-galactosidase da SPRIN Tecnhologies®, both with origin in the Kluyveromyces lactis microorganism. The enzymatic activity and operational stability of these enzymes was studied at 45C of temperature and pH 7 under a specific substrate, 2-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG), once that their hydrolysis mechanism is similar to the lactose and in the food matrices, cheese whey, UHT milk commercialized in the hypermarket and sheep milk which has not suffered any thermal treatment. Besides from the commercialized shapes study, essays with Lactozym 2600L enzyme, immobilized in calcium alginate spheres, as well as magnetization using iron oxide (II,III) from Sigma-Aldrich with the SPRIN Imibond-galactosidase and the calcium alginate spheres with the free and immobilized enzyme were also performed. High hydrostatic pressure essays were also performed but only with the ONPG substrate, to verify if the enzymes would maintain their activity when submitted to pressures between 50 and 1200 MPa under temperatures of 25, 45 and 65ºC. It was intended to simulate the pasteurization conditions in food matrices but due to operational problems these essays were not possible. From all the enzymes used in this essays, Lactozym 2600L in its free shape and then immobilized in calcium alginate spheres, which presented the best results. At the end of this work, microbiology essays were performed to verify the antimicrobial action of the calcium alginate in the non-treated sheep milk, through the total microorganism research at 30ºC as well as Enterobacteriaceae , based in the ISO 4833-2 and 21528-2