Broad-spectrum antiviral peptides against respiratory viruses

Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2016O vírus Influenza A pertence à família Orthomyxoviridae sendo responsável por transmitir infeções virais agudas do trato respiratório, como a gripe. Este vírus apresenta uma distribuição a nível global e uma elevada taxa de transmissibilidade. A gripe afeta maioritariamente crianças, idosos e pessoas com o sistema imunitário mais debilitado. Apresenta como sintomas, febre, dores de garganta, dores musculares, dores de cabeça, tosse, fadiga e sensação geral de desconforto. Este vírus normalmente é transmitido por via aérea através de tosse ou de espirros, isto porque através destas ações são libertadas partículas que contêm o vírus. Estas partículas podem ser inaladas por outras pessoas, infetando as mesmas, acabando por desencadear a doença. Outra forma de transmitir a gripe é através do contacto com superfícies contaminadas. O vírus influenza A apresenta uma forma esférica e contém um envelope viral onde estão inseridas duas glicoproteínas, a hemaglutinina e a neuraminidase, e um canal iónico, o M2. O genoma viral é composto por RNA de cadeia simples negativa. A hemaglutinina apresenta um papel crucial na entrada do vírus para a célula, uma vez que é através da mesma que os recetores de acido siálico são reconhecidos e, para além disto, também participa no processo de fusão, onde após a diminuição do pH dentro do endossoma sofre uma alteração na sua conformação que a leva a expor o péptido de fusão. Por outro lado, a neuraminidase participa na libertação do vírus a partir das células infetadas. A prevenção e o controlo da transmissão deste vírus passa pelas vacinas e antivirais já existentes no mercado. Devido à elevada taxa de mutação do genoma do vírus, o tratamento existente no mercado não é eficaz contra os vírus resistentes. É o caso dos inibidores da neuraminidase, como o oseltamivir e zanamivir, e os inibidores do canal iónico M2, como a amantidina e rimantadina, que impedem que o vírus infete células. Estes antivirais já são comercializados, no entanto, têm vindo a ser retirados do mercado devido à existência de efeitos secundários graves e pelo facto de os vírus que têm aparecido mais recentemente apresentarem mutações resistentes a estes antivirais. Deste modo, é importante encontrar novos alvos de ação para combater a infeção por parte do vírus influenza. Uma das hipóteses passa por desenvolver agentes antivirais, que têm a capacidade de inibir a fusão membranar entre o vírus e a célula-alvo. Esta estratégia foi aplicada com sucesso contra o vírus da imunodeficiência humana (HIV), estando a ser alargada para mais vírus envelopados como é o caso do vírus influenza. A inibição da fusão das membranas virais e do hospedeiro é uma estratégia que tem vindo a ser estudada. Este passo é essencial para a infeção da célula alvo por parte do vírus. Uma vez inibido, o vírus perde a capacidade de infectar a célula do hospedeiro, e como consequência não ocorre a propagação viral dentro do hospedeiro. Nesta dissertação foram estudados três péptidos com potencial para inibir a fusão membranar do vírus influenza com a membrana celular. Estes péptidos foram desenhados a partir da região CHR da cadeia HA2 da hemaglutinina, que aparenta ser a zona mais conservada da proteína. Todos os péptidos derivados dessa região têm a denominação de péptidos C ou inibidores de fusão classe I. Portanto, estes péptidos mimetizam a região CHR da proteína viral hemaglutinina e ligam-se à região complementar (NHR) também pertencente à mesma proteína. Os três péptidos em estudo apresentam a mesma sequência peptídica, contundo são diferentes entre si em temos de derivatização. A denominação “Influenza” será atribuída à sequência peptídica. O primeiro péptido, Influenza-PEG4-Colesterol, apresenta um espaçador com quatro unidades de polietilenoglicol que separa a região peptídica e um domínio lípido, o colesterol. Este péptido já foi estudado anteriormente por nossos colaboradores do Centro Médico da Universidade de Columbia, em Nova Iorque, que tambem nos forneceram estes péptidos. Pelos estudos realizados com o péptido foi possível concluir que este consegue bloquear a fusão do vírus através da ligação à hemaglutinina e posteriormente incapacitando a mesma de alterar a sua conformação, que é um passo essencial para a fusão. Os restantes dois péptidos são derivados do Influenza-PEG4-Colesterol, sendo que um apresenta apenas a cadeia peptídica sem domínio lipídico e o outro é constituído por duas cadeias peptídicas e está conjugado com uma molécula de colesterol, (Influenza-PEG4)2-Colesterol. Este projeto teve como objetivo estudar a interação do péptido Influenza-PEG4-Colesterol e os seus derivados com sistemas modelo de biomembranas e igualmente com membranas de algumas células do sangue, nomeadamente eritrócitos e linfócitos. A avaliação desta interação foi efetuada através de metodologias de espectroscopia de fluorescência. O primeiro ensaio teve como objetivo avaliar se os péptidos interagem com a membrana de vesiculas lipídicas de diferentes composições, POPC e de POPC:Colesterol (2:1). Esta avaliação é possível uma vez que os péptidos apresentam um ou dois (no caso do dímero) resíduos de triptofano na sua constituição e como se sabe, o triptofano apresenta fluorescência intrínseca. Esta fluorescência intrínseca é uma ferramenta válida para averiguar a inserção dos péptidos nas vesiculas, sendo que à medida que existe uma alteração da fluorescência é sinal que o péptido estará mais inserido na membrana. Neste caso, através da excitação seletiva dos resíduos de triptofano e deteção da emissão de fluorescência dos mesmos, foi possível observar que o dímero apresentou maioritariamente melhores resultados, tendo tido valores de Kp superiores aos dos restantes péptidos, tendo maior afinidade para vesículas que contêm colesterol. Uma vez que estes péptidos apresentam colesterol na sua constituição, têm uma maior tendência para formar agregados. Através da sonda ANS que se torna fluorescente quando se insere em microambientes hidrófobos, foi possível observar que tanto o Influenza-PEG4-Colesterol como o (Influenza-PEG4)2-Colesterol agregam em solução. Como já era expectável, o péptido que não apresenta nenhuma componente lipídica, não sofre agregação. De seguida, através de extintores de fluorescência em solução aquosa (acrilamida) e em membrana (5NS e 16NS) foi possível determinar a posição do resíduo de triptofano nas membranas lipídicas. O péptido que não apresenta nenhum domínio lipídico, apresenta o resíduo de triptofano bastante acessível ao ambiente aquoso, o que nos permite explicar a não existência de partição das membranas. Os restantes péptidos mostraram estar mais inseridos na membrana e por isso, sofreram menos extinção de fluorescência por parte da acrilamida. A presença do domínio lipídico poderá permitir ao péptido uma maior interação com as membranas. De maneira a avaliar esta interação foi utilizada uma sonda sensível ao potencial de dipolo das membranas, a sonda di-8-ANEPPS. Inicialmente foram marcados lipossomas com esta sonda para testar a interação dos péptidos com os mesmos. Neste caso, não foi registada praticamente nenhuma alteração no potencial de dipolo das membranas dos lipossomas. De maneira a estudar a interação com células, tanto os eritrócitos como os linfócitos foram marcadas com a mesma sonda. Contrariamente ao que foi observado com os lipossomas, já houve uma maior interação por parte dos péptidos com as membranas das células. O Influenza-PEG4-Colesterol demonstrou ter maior afinidade para os eritrócitos a pH 7 e o péptido (Influenza-PEG4)2-Colesterol demonstrou ter uma afinidade maior para os linfócitos, também a pH 7. Um estudo realizado neste grupo, para péptidos inibidores de fusão para o HIV, o HIVP4 (que é também um dímero com um domínio de colesterol) também apresentou uma maior afinidade para linfócitos. Resumidamente, o péptido que não tem colesterol não interage com as membranas lipídicas através do resíduo de triptofano, nem aparenta agregar em solução aquosa devido a ausência de domínio de colesterol. Em relação ao dímero, este apresentou melhores resultados na partição e na interação com células. Este péptido foi o que apresentou uma melhor afinidade quando presente em ambiente com pH acídico. O facto de este péptido apresentar melhores resultados que o monómero poderá demonstrar que a dimerização do péptido pode ser fundamental, uma vez que influencia a concentração do péptido ao nível da membrana. A conjugação de um domínio lipídico, como o colesterol, e a dimerização aparentam ser estratégias que aumentam a atividade antiviral dos possíveis inibidores de fusão do influenza A.Influenza viruses (IV) are major human pathogens responsible for respiratory diseases affecting millions of people worldwide and characterized by high morbidity and mortality. Infections by influenza can be controlled by vaccines and antiviral drugs. However, this virus is constantly under mutations, leading to growing resistance to influenza antivirals currently in use. It is urgent to develop new strategies for therapeutics. Influenza hemagglutinin (HA) is a potential target for antiviral drugs, because it is a key protein in the initial stages of infection. This protein is involved in receptor binding and promotes the (pH-dependent) fusion of virus and cell membranes after endocytosis. HA-targeted peptides are expected to lead to novel anti-influenza drugs. Cholesterol conjugated HA-derived peptides with anti-fusion activity against influenza have been previously studied on live virus. In this study, we evaluated three HA-derived peptides using fluorescence spectroscopy. Membrane partition assays were performed at two different pH values to assess the interaction with biomembrane model systems and (Influenza-PEG4)2-Chol presented the highest partition in all the conditions. Peptide aggregation was also assessed by the ANS probe. Human blood cells were used to evaluate the extent of cell membrane binding, using the dipole potential probe di-8-ANEPPS. In this assay the dimer peptide showed to have higher affinity for PBMC and the monomer for erythrocytes. Preferential localization of tryptophan in lipid bilayers was also assessed, using aqueous-soluble and lipophilic quenchers. It was possible to observe that the untagged peptide is at a shallow position. Therefore, the tryptophan residue is more accessible to acrylamide and the cholesterol-tagged peptides are more inserted in the membranes. In conclusion, cholesterol-tagged peptides and dimerization may be used to increase the activity of the peptides. Our results provide new insight into molecular interactions between HA-derived peptides and cell membranes, which may contribute toward the development of new influenza A virus inhibitors