Isolation and characterization of microorganisms with probiotic potential

Tese de mestrado em Microbiologia Aplicada, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016A microbiota intestinal define-se como a totalidade de microrganismos que se encontram no trato gastrointestinal, sendo a sua composição variável de indivíduo para indivíduo. Esta comunidade microbiana assume um papel preponderante na saúde humana, pois influencia o hospedeiro ao nível metabólico, nutricional, fisiológico e imunológico. A perturbação da microbiota normal, denominada disbiose, está associada a várias doenças. Desta forma, torna-se importante modular esta microbiota, de forma a prevenir ou tratar eventuais episódios de doença. Uma possível abordagem é através da ingestão de produtos probióticos. Probióticos são microrganismos vivos que, quando administrados em quantidades adequadas, conferem benefícios à saúde do hospedeiro. A maioria destes microrganismos pertencem ao grupo das bactérias lácticas, principalmente aos géneros Lactobacillus e Bifidobacterium, e podem ser incluídos em vários tipos de produtos alimentares ou suplementos, nomeadamente em produtos lácteos fermentados como os iogurtes, ou alternativamente em vegetais, produtos baseados em cereais, entre outros. Os probióticos podem ser isolados de várias fontes, sendo as principais os produtos lácteos e o trato intestinal humano. No entanto, outros produtos fermentados, como por exemplo os baseados em vegetais, também podem ser fontes importantes para o seu isolamento. O chucrute é um destes produtos, resultando da fermentação espontânea de couve após a adição de sal. Esta fermentação é caracterizada por uma sucessão microbiana que pode ser dividida em duas etapas. A primeira apresenta uma maior quantidade de microrganismos heterofermentativos, enquanto a segunda apresenta um maior número de organismos homofermentativos. As espécies Leuconostoc mesenteroides e Lactobacillus plantarum são as mais comuns durante a fermentação do chucrute, apesar de já terem sido observadas outras espécies bacterianas, em quantidades mais reduzidas. Várias características devem ser consideradas na seleção de microrganismos probióticos, sendo que estas são normalmente específicas de cada estirpe. Primeiro, é necessário avaliar o perfil de segurança dos candidatos a probióticos em relação ao organismo humano, existindo poucos casos de probióticos prejudiciais para a saúde humana. Outra questão importante é a presença de genes de resistência a compostos antimicrobianos que possam ser transmissíveis a outros microrganismos. Para além disto, os candidatos devem conseguir sobreviver às condições rigorosas presentes no trato gastrointestinal, tais como o baixo pH e a presença de bílis e enzimas digestivas, e possuir capacidade de adesão a este órgão, de forma a que o possam colonizar eficazmente. Por fim, estes microrganismos devem produzir um efeito benéfico para o organismo humano. Vários benefícios decorrentes da utilização de probióticos já foram descritos para o tratamento e prevenção de doenças gastrointestinais, como é o caso da diarreia associada a antibióticos, a gastroenterite infeciosa, algumas doenças inflamatórias intestinais, entre outros. Além disso, também já foi observado um efeito benéfico no tratamento de infeções do trato respiratório. Outros benefícios para a saúde humana necessitam de mais provas para que sejam comprovados, como por exemplo o tratamento de infeções causadas por Helicobacter pylori e da rinite alérgica e a prevenção da dermatite alérgica, havendo além disso outros possíveis efeitos benéficos ainda em estudo. Para conferirem um efeito benéfico, os microrganismos probióticos atuam através de determinados mecanismos de ação. Vários destes mecanismos já foram descritos: 1) interação com o hospedeiro, através do fortalecimento da barreira intestinal, estimulação da produção de péptidos antimicrobianos, e interação com células do sistema imunitário, entre outros; 2) interação com outros microrganismos, como por exemplo competição por nutrientes limitantes, competição pela adesão ao trato gastrointestinal, ou atividade antimicrobiana contra estes; 3) interação com moléculas presentes no ambiente gastrointestinal. O estudo das características e benefícios dos probióticos normalmente é realizado através de estudos in vitro, mas um método importante para a ligação destes com os seus efeitos em seres humanos é através da utilização de modelos animais in vivo. O nematode Caenorhabditis elegans é um modelo animal amplamente estudado, apresentando várias vantagens como a sua facilidade de manutenção e o seu ciclo de vida curto. Este nematode tem sido utilizado recentemente para o estudo dos efeitos probióticos de microrganismos, e pode também ser aplicado como um modelo de infeção para várias bactérias patogénicas. O presente trabalho teve como objetivo o isolamento e caracterização de microrganismos probióticos a partir de fermentações de chucrute. Seis tipos de fermentações foram realizadas em triplicado, usando como substrato três variedades de couve (portuguesa, coração de boi ou lombarda) com ou sem a adição de ervas aromáticas. O pH, produção de ácido e quantidade de bactérias lácticas viáveis foram analisados ao longo do tempo das fermentações, procedendo-se também ao isolamento de bactérias lácticas durante este período. De seguida, os isolados foram caracterizados fenotipicamente, através da realização da coloração de Gram e dos testes da catalase e oxidase; e genotipicamente através de PCR-fingerprinting e multiplex PCR, permitindo a sua identificação ao nível do género. Isolados representativos foram avaliados em termos de segurança, através da determinação da atividade hemolítica e do perfil de resistência a compostos antimicrobianos; e do seu potencial probiótico, através da caracterização de atividade antimicrobiana e resistência a pH baixo e à presença de bílis. Para além disso, C. elegans foi utilizado como modelo animal para analisar o potencial probiótico ou patogénico dos isolados mais promissores. As fermentações de chucrute parecem ter decorrido adequadamente, apresentando uma evolução dos seus parâmetros ao longo do tempo semelhante à descrita na literatura, apesar de alguns destes não atingirem os valores descritos. Quatro destas fermentações foram escolhidas e 114 isolados foram caracterizados através da realização de testes fenotípicos e genotípicos, que permitiram a escolha de isolados representativos. A maioria destes foram identificados como Lactobacillus spp. (52%), e alguns como Leuconostoc spp. (33%), sendo que a frequência de microrganismos destes géneros foi diferente entre as fermentações, claramente dependendo do tipo de couve utilizada como substrato. De igual modo, a diversidade microbiana também diferiu conforme a fermentação. Em relação ao perfil de segurança, apenas um isolado apresentou atividade beta-hemolítica, e desta forma foi possível concluir que os isolados parecem possuir um reduzido grau de virulência. Relativamente à resistência a compostos antimicrobianos, os isolados apresentaram uma elevada percentagem de resistência à vancomicina, e uma baixa percentagem de resistência à ampicilina, cloranfenicol e clindamicina. A incidência de resistência à eritromicina, gentamicina, canamicina, estreptomicina e tetraciclina foi variável, dependendo do género em estudo. Em geral, 42% dos isolados mostraram resistência a pelo menos um composto antimicrobiano associado à transmissibilidade a outros microrganismos. Quanto à resistência a condições que simulam o trato gastrointestinal, 88% dos isolados apresentaram resistência à presença de bílis, enquanto 20% demonstraram resistência a valores baixos de pH. Seis isolados foram escolhidos com base nos resultados obtidos nos testes anteriores e mostraram atividade antimicrobiana contra Listeria monocytogenes. Três apresentaram resistência a valores mais baixos de pH do que os valores anteriormente testados. Por fim, dois dos três microrganismos com maior potencial probiótico foram estudados utilizando o modelo C. elegans. Os isolados, por si só, não demonstraram nenhum efeito benéfico para o organismo dos nematodes. No entanto, quando os vermes foram colocados em contacto com uma estirpe patogénica de Serratia sp. após contacto com os candidatos probióticos, verificou-se um efeito sinergístico entre estes, ocorrendo desta forma o aumento da patogenicidade da estirpe de Serratia em estudo. Os resultados obtidos indicam que os microrganismos estudados podem não ser apropriados para aplicação como probióticos, e devem ser melhor caracterizados. Em conclusão, 114 isolados de fermentações de chucrute foram caracterizados quanto ao seu potencial para aplicação como microrganismos probióticos, tendo-se verificado que três destes apresentaram características apropriadas para tal. Desta forma, comprova-se a aplicabilidade das fermentações de chucrute como fonte para o isolamento de microrganismos probióticos. Apesar de dois dos três candidatos não terem apresentado um efeito benéfico quando testados no modelo C. elegans, é importante referir que mais testes deverão ser realizados no futuro para avaliar o potencial probiótico destes microrganismos, nomeadamente através do uso de outras estirpes patogénicas ou da aplicação de outros modelos in vivo.Probiotics are live microorganisms which, when administered in adequate amounts, confer health benefits to the host. Various benefits have been described, particularly those pertaining to improvements in gastrointestinal diseases. Probiotics may be isolated from several sources, one of these being vegetable products. Sauerkraut is a fermented cabbage product, resulting from fermentation by a lactic acid bacteria microbial succession, and therefore it can be a potential source of probiotic candidates. Nonetheless, several characteristics should be addressed in order to consider the use of a microorganism as a probiotic, including its safety, resistance to gastrointestinal tract conditions and ability to produce a health effect on the host. The objective of the present work was the isolation and characterization of probiotic microorganisms from sauerkraut fermentations. Isolated microorganisms were characterized phenotypically and genotypically, identified to the genus level and their safety and probiotic potential was evaluated. Furthermore, Caenorhabditis elegans was used as an animal model to analyze the probiotic potential of selected bacteria. Sauerkraut fermentations developed successfully and 114 isolates, originating from four different fermentation recipes, were further characterized. After phenotypic and genotypic analysis, representative isolates were chosen, 52% of these being Lactobacillus spp. and 33% Leuconostoc spp. LAB diversity and composition throughout fermentation differed depending on the type of cabbage used as substrate for sauerkraut production. Only one isolate presented β-hemolysis, and 42% were resistant to at least one antimicrobial compound associated with transmissibility to other microorganisms. Regarding resistance to gastrointestinal conditions, 88% of isolates were resistant to bile and 20% to low pH. Six probiotic candidates were further studied, all of them possessing antimicrobial activity against Listeria monocytogenes and three being resistant to lower pH values than previously tested. Two of the best candidate isolates were tested using the C. elegans model, but did not present a protective effect against Serratia sp. Instead, a synergistic effect was observed, increasing its pathogenicity. Our results confirmed the applicability of sauerkraut fermentations as a source for probiotic isolation. Three candidates were isolated from these fermentations, and although two of them did not show probiotic characteristics in the C. elegans model tests, further work must be done in order to fully characterize these isolates and clarify their probiotic potential