Unveiling the physiological and molecular basis of Mycobacterium tuberculosis complex biofilms: the potential role of Rv2488c

Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2016The Mycobacterium tuberculosis complex (MTC) includes several closely-related pathogenic species, namely M. tuberculosis, the main etiological agent of human tuberculosis (TB), and M. bovis, the causative agent of bovine tuberculosis (bTB), one of the most relevant zoonosis in the world. The complex pathogenesis of MTC bacteria is influenced by several factors, including host and bacterial genetic backgrounds and environmental factors. On infection, a proportion of infecting bacilli is able to survive and strive among the challenging conditions present in the host’s macrophage. Current models of mycobacterial persistence invoke the presence of dormant populations of non-growing cells that reactivate during host immunosuppression. Bacterial biofilms, described as single or multispecies communities triggered by cell-density dependent Quorum-Sensing (QS) events, exhibit heterogeneous and stress-tolerant populations that thrive under inhospitable niches and display recalcitrant characters, such as increased xenobiotic tolerance and resistance to host’s immune response. M. tuberculosis infections in humans have similarities to microbial biofilms, displaying antibiotic resistance, asymptomatic latency and a persistence phenotype associated to a dormant and non-replicating state of infecting microorganisms that enables evasion from the host’s immune system. The clinical phenotype of TB thus raises the question of whether or not M. tuberculosis latent infections are associated to the biofilm phenotype in vivo and if these multicellular structures may allow persistence of infection and recalcitrance to xenobiotic through time. Biofilm formation and maturation is modulated by cell density and the accumulation of signaling molecules (autoinducers) that bind a cognate response regulator and initiate a transduction cascade, triggering QS-dependent gene expression. Contrasting with the well-studied QS circuits of many pathogenic bacterial species, mycobacterial QS mechanisms remain poorly explored. The recent bioinformatic analysis of 53 actinobacterial genomes highlighted the presence of several putative LuxR response regulator determinants in mycobacteria. Interestingly, pathogenic members of MTC exhibit three coding DNA sequences (CDS), one of which is Rv2488c, presenting an unprecedented architectural organization that simultaneously associate adenylate cyclase and LuxR domain sequences. Being coupled with adenylate cyclase activity, we hypothesized that LuxR regulators may potentially respond to a wider range of environmental signals, enabling the cell to more efficiently cope with deleterious stress. This study aimed to identify which environmental conditions favor the establishment and maturation of biofilms by MTC bacteria in vitro and to explore the microdiversity of LuxR-like Rv2488c within circulating M. tuberculosis and M. bovis strains, also evaluating Rv2488c recruitment by the cell through the assessment of its transcriptional profile under the conditions that mimic host microenvironment. The bioinformatic analyses of Rv2488c sequences from 81 MTC publicly available genomes denoted a highly heterogeneous pattern among M. tuberculosis strains, specifically through the accumulation of single nucleotide polymorphisms (SNPs) and/or INDELs that were more prevalent at the DNA-binding and cyclase homology domains, while the 25 M. bovis isolates under scrutiny depicted high degree of conservation. The polymorphisms found were used to simulate three-dimensional protein models, showing that the correspondent structural architecture is altered when compared to reference M. tuberculosis H37Rv, also suggesting functional impairment of the encoded protein in several clinical M. tuberculosis strains due to frameshift-causing INDELs. The neighbor joining cladograms inferred from the analyzed M. bovis and M. tuberculosis sequences thus suggest different evolutionary pressure and microevolutionary history of Rv2488c among these two MTC ecotypes, possibly reflecting host niche adaptation. Batch culture growth of M. bovis BCG Tokyo, M. smegmatis mc2 155 and two field M. bovis strains (I and II) under in vitro environmental conditions mimicking host’s microenvironment and phagosomal maturation, including low pH, magnesium or iron starvation, reactive oxygen intermediates, acetate as alternative carbon source and toxic rifampicin challenge, was tested in modified Middlebrook 7H9 broth to disclose the associated physiological and transcriptional responses. Viable cell count, survival percentage, specific growth rate and OD590 of crystal violet-stained attached cells, were determined to compare mycobacterial physiology upon stress. Exposure to acid (pH 5.5) using sodium pyruvate as carbon source impaired M. bovis growth, leading to slower metabolism (two-fold reduction in specific growth rate) and severely affecting the final amount of biomass in suspension (reduction of viable cell count in five orders of magnitude and survival percentage to 0.00127%, as compared to control). Growth of M. bovis under the presence of rifampicin 25 μg/ml decreased survival percentage to 50%, although the observed effect in growth rate was less pronounced than the one induced by low pH. Mycobacterial cells formed reticulated pellicles at the air-medium interface and attached to the periphery of 12 well-microtitre plates under specific stresses. Considering the effect of rifampicin challenge on attached growth, although survival percentage significantly decreased for three Mb strains upon antibiotic exposure, cell attachment was similar to control, which, considering the biofilm/survival ratio, suggests that rifampicin may enhance biofilm formation by MTC bacteria as a mean to cope with stress. When cells were grown under magnesium or iron starvation, slower growth patterns and final biomass yields were registered, while mycobacterial suspensions depicted macroscopically visible cord-like structures, suggesting that competition for oligoelements that are crucial for fundamental cellular activities stimulate cell aggregation and thus may stimulate biofilm coordinated responses. Transcriptional profiling of Rv2488c in the established stress conditions revealed differential transcriptional responses prone to variation among two M. bovis field strains and dependent on environmental cues, with pH 5.5 exerting 131-fold induction of Rv2488c. Growth under iron or magnesium starvation or upon rifampicin challenge did not affect Rv2488c expression. The construction by specialized transduction of a knock-out isogenic mutant to study Rv2488c role in mycobacteria physiology was also envisaged and advanced, but not fully completed in the scope of this work. Comparison of in vitro growth of wild-type and isogenic knock-out strains in batch assays and macrophage cell lines and, also in vivo using an animal model of infection, would enable unveiling the possible role of Rv2488c to bacilli survival inside the host, considering the mycobacteria-host axis. Altogether, findings from this work suggest that, in contrast with M. bovis, Rv2488c has accumulated several mutations in Mycobacterium tuberculosis contemporary strains, some of them damaging its regulatory domains and destroying its protein-coding potential, which suggest pseudogenization of this genomic region. However, in M. bovis, Rv2488c is transcribed and preliminary findings from our group suggest that its transcription may be articulated with global gene expression networks, suggesting that it may ensure a significant biological function to be disclosed in the future.O complexo Mycobacterium tuberculosis (MTC) inclui várias espécies patogénicas, filogeneticamente próximas e com evolução clonal, que se adaptaram a nichos ecológicos e hospedeiros específicos. Neste grupo de bactérias, incluem-se M. tuberculosis, o principal agente etiológico da tuberculose humana (TB), e M. bovis, o agente da tuberculose bovina (bTB), sendo esta uma das mais importantes zoonoses a nível mundial. Permanecendo como uma das doenças infeciosas com maior impacto, tendo a Organização Mundial de Saúde estimado em 2013 que um terço da população humana estaria latentemente infetada, a tuberculose traduz-se num flagelo de saúde pública, com elevadas taxas anuais de incidência e de mortalidade, especialmente em indíviduos imunocomprometidos, nomeadamente co-infetados com o vírus da imunodeficiência adquirida (HIV), causando ainda elevados prejuízos monetários. Pensa-se que a patogenia das espécies do MTC é influenciada por numerosos fatores, tais como fatores genéticos do hospedeiro e do microrganismo, assim como por fatores ambientais. Durante a infeção, e focando apenas a tuberculose pulmonar, uma proporção de bacilos infetantes é capaz de sobreviver e multiplicar-se com sucesso na presença das condições de stresse encontradas no interior do macrófago alveolar. Os atuais modelos de persistência micobacteriana invocam a presença de populações de células dormentes que se reativam e disseminam após imunosupressão do hospedeiro. Os biofilmes são constituídos por células microbianas imersas numa matriz de exopolissacáridos que conferem proteção significativa aquando da fixação da comunidade a um ambiente desfavorável. Nestas microcomunidades distinguem-se subpopulações heterogéneas de bactérias que demonstram um caráter recalcitrante, como tolerância a xenobióticos e resistência aumentada a condições ambientais inóspitas. A comunicação intercelular (quorum sensing, QS) nestas condições, mediada por sinais químicos específicos, permite às populações bacterianas cooperar fisiologicamente e ajustar a expressão génica e os níveis metabólicos em consonância para melhor persistirem no ambiente. Do ponto de vista clínico, a formação de biofilmes está tipicamente associada a infeções crónicas, conduzindo a um aumento da resistência microbiana a antibióticos e protegendo o agente patogénico da resposta imunitária do hospedeiro, pelo que a agregação das células nestas estruturas pode ser entendida como uma estratégia de sobrevivência, persistência e resistência a stresses ambientais subversivos. Devido à sua natureza hidrofóbica, as micobactérias tendem a formar estes agregados de células in vitro, sendo ainda desconhecido se adotam in vivo um fenótipo semelhante ao dos biofilmes, estando também por identificar os determinantes genéticos que promovem uma resposta de crescimento em biofilmes. A análise comparativa de genomas de micobactérias saprófitas e bactérias do MTC sugere que o gene Rv2488c seja um presumível regulador transcricional pertencente à família LuxR, a qual inclui genes que codificam proteínas envolvidas em fenómenos de regulação da expressão genética mediados por quorum sensing. A análise, por pesquisa de homologia nas bases de dados, dos domínios funcionais subjacentes a esta sequência de DNA codificante sugere ainda a presença de uma região associada à atividade de adenilato ciclase, pelo que se presume que a proteína resultante exercerá atividade regulatória da expressão génica de forma específica em resposta a diferentes estímulos ambientais. Este trabalho teve como objetivo identificar as condições ambientais que favorecem a formação de biofilmes por bactérias do complexo M. tuberculosis e explorar a microdiversidade do gene Rv2488c nas estirpes circulantes de M. tuberculosis e M. bovis, avaliando-se ainda a sua expressão em condições semelhantes às presentes no hospedeiro e/ou que propiciam o estabelecimento e maturação de biofilmes. A análise bioinformática dos polimorfismos do gene Rv2488c em 81 estirpes do complexo M. tuberculosis cujos genomas se encontram disponíveis nas bases de dados internacionais demonstrou que a sequência desta região codificante apresenta elevado grau de conservação entre as estirpes de M. bovis, enquanto que nas estirpes de M. tuberculosis contemporâneas e atualmente em circulação existe grande variação nucleotídica, com acumulação de polimorfismos de nucleótido único (SNPs), inserções e eliminações em regiões específicas. A acumulação de variações nucleotídicas regista particular incidência nos domínios de ligação ao DNA e de adenilato ciclase, o que, à primeira vista, sugere pressão evolutiva nestes domínios, eventualmente para refinar a resposta a diferentes estímulos ambientais, permitindo uma expressão genética mais controlada e específica. A modelação da estrutura tridimensional das proteinas resultantes visou avaliar as presumíveis consequências estruturais e funcionais decorrentes da acumulação dos polimorfismos identificados, verificando-se que as alterações mais frequentes provocam um rearranjo tridimensional distinto, com alteração espacial e posição distal dos domínios de ciclase e LuxR, o que sugere consequências funcionais na atividade da proteína, nomeadamente na sua capacidade de interação com ligandos específicos. Foram também detetadas alterações das sequências nucleotídicas de Rv2488c em estirpes clínicas de M. tuberculosis que levam à disrupção da grelha de leitura e interrupção precoce da tradução da proteina codificada, afetando drasticamente, e eventualmente inativando, a sua potencial função. A partir dos genomas disponíveis nas bases de dados de M. bovis e M. tuberculosis foram construídos cladogramas para avaliação da microevolução de Rv2488c, procedendo-se à sua análise filogenética. Os resultados obtidos sugerem diferentes padrões microevolutivos deste gene nos dois ecotipos do MTC que possivelmente refletem a adaptação específica dos dois agentes etiológicos aos respetivos hospedeiros. Realizou-se o crescimento em descontínuo de M. bovis BCG Tokyo, M. smegmatis mc2 155 e duas estirpes de campo de M. bovis (I e II) em meio Middlebrook 7H9 modificado com o objetivo de caraterizar a resposta fisiológica e transcricional destas estirpes in vitro a condições ambientais que mimetizam o microambiente do hospedeiro e a maturação do fagossoma, tais como stress ácido, a presença de intermediários reativos de oxigénio, acetato como fonte de carbono, concentrações tóxicas de rifampicina e concentrações residuais de magnésio e ferro. Para determinar e comparar a resposta fisiológica das várias estirpes após exposição às condições impostas, foram determinadas taxas específicas de crescimento, número de células viáveis, percentagens de sobrevivência e densidades ópticas a 590 nm das frações celulares aderidas a superfícies e coradas com violeta de cristal. A exposição a choque ácido (pH 5.5) usando piruvato de sódio como fonte de carbono afetou o crescimento de M. bovis, induzindo a desaceleração do metabolismo (taxa específica de crescimento reduzida em duas vezes) e afetando severamente a biomassa final em suspensão, com a redução da contagem de células viáveis em cinco ordens de magnitude e uma percentagem de sobrevivência de 0.00127%, comparando com o controlo. O crescimento de M. bovis na presença de 25 μg/ml de rifampicina levou a um decréscimo da percentagem de sobrevivência de 50%, apesar do efeito observado na taxa de crescimento ter sido menos pronunciado em comparação com o induzido pelo choque ácido. As culturas de micobactérias formaram películas reticuladas na interface entre o meio de cultura-ar e as células fixaram-se na periferia dos poços das microplacas sob stresses específicos. Considerando o efeito da rifampicina na adesão das células aos poços das microplacas, apesar da percentagem de sobrevivência após exposição ao antibiótico ter decrescido significativamente para três estirpes de M. bovis, a fração celular aderida foi similar à do controlo, o que, considerando o rácio entre biofilme/sobrevivência, sugere que a rifampicina poderá aumentar a formação de biofilmes por bactérias do MTC como mecanismo para lidar com o stress imposto. Quando as células foram expostas a concentrações residuais de magnésio ou ferro, registaram-se padrões de crescimento e rendimentos de biomassa final formada mais baixos, no entanto visualizaram-se estruturas macroscópicas semelhantes a corda em suspensão, sugerindo que a competição por nutrientes minerais essenciais a atividades celulares fundamentais estimula a agregação celular e possivelmente uma resposta coordenada através da formação de biofilmes. O perfil transcricional do gene Rv2488c em duas estirpes de campo de M. bovis nas condições de stress estabelecidas apresentou diferenças, sugerindo diferentes respostas transcricionais aos estímulos ambientais, com o stress ácido (pH 5.5) a exercer uma indução do gene alvo em 131 vezes numa das estirpes. O crescimento com concentrações residuais de nutrientes minerais ou após exposição a rifampicina não afetou a expressão do gene Rv2488c em qualquer das estirpes estudadas. A construção por transdução especializada de um mutante de eliminação para estudar o papel do gene Rv2488c na fisiologia micobacteriana foi delineada e avançada, embora não inteiramente concluida no âmbito do presente trabalho. A comparação do crescimento da estirpe selvagem e do mutante isogénico em descontínuo, em linhas celulares de macrófagos ou num modelo animal de infeção poderia permitir desvendar o possível papel do gene para a sobrevivência do bacilo no interior do hospedeiro, considerando o eixo micobactéria-hospedeiro. Em suma, os resultados deste trabalho sugerem que, em contraste com M. bovis, o gene Rv2488c tem acumulado várias mutações em estirpes clínicas atuais de Mycobacterium tuberculosis, algumas danificando os seus domínios regulatórios e destruindo o seu potencial de codificação de uma proteína funcional, o que sugere pseudogenização desta região genómica. No entanto, em M. bovis, o gene Rv2488c é transcrito e resultados preliminares do nosso grupo sugerem que a sua transcrição pode ser articulada com redes globais de expressão génica, sugerindo que este gene poderá assegurar uma função biológica importante a ser desvendada no futuro