Caracterização química e avaliação da atividade biológica da framboesa (Rubus idaeus L.) : contribuição para o desenvolvimento de uma alegação de saúde

Tese de doutoramento, Farmácia (Bromatologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2016As doenças crónicas, atualmente a principal causa de morte em todo o mundo, têm aumentado dramaticamente consequência das modificações de estilos de vida, nomeadamente sedentarismo, níveis elevados de stresse e alterações na dieta. Segundo a OMS estas mortes prematuras podem ser prevenidas. A promoção de hábitos alimentares saudáveis, tais como o aumento da ingestão de frutas e produtos hortícolas, a principal fonte de (poli)fenóis bioativos, constitui uma via para a proteção da saúde das populações. A framboesa vermelha (Rubus idaeus L.) é um fruto de produção recente em Portugal. Este pequeno fruto vermelho constitui uma fonte dietética de compostos bioativos, incluindo compostos fenólicos, antocianinas e elagitaninos, que têm demonstrado atividades biológicas antioxidante, anti-inflamatória, antimicrobiana, antiproliferativa e anticancerígena, entre outras. Existem alguns estudos sobre os efeitos fisiológicos destes frutos mas poucos foram realizados em animais e humanos, e tendo isso em consideração o nosso estudo teve por objetivo a caracterização química e biológica de frutos de Rubus idaeus L. produzidos em território nacional visando dar um contributo para o desenvolvimento de uma alegação de saúde. Assim, amostras de frutos de Rubus idaeus L. da região de Odemira, Alentejo Litoral, foram caracterizadas quimicamente: genótipos distintos, produzidos na zona de Odemira entre 2011 e 2013; um extrato de uma amostra de framboesas colhidas em 2010 que foi usado na avaliação da atividade biológica (capacidade antioxidante e anti-inflamatórias) in vitro e in vivo em modelos celulares e animais; uma amostra de framboesas maduras da cv. Amira ingeridas por voluntários saudáveis num estudo de intervenção nutricional (ENIH). A caracterização fenólica foi realizada em extratos (metanol e acetona) por técnicas cromatográficas e de espetrometria de massa (HPLC-DAD e LC-DAD-MS/MS, MALDI-TOF-MS) e espetrofotométricas (fenóis totais, FT, flavonóides totais, FLT, antocianinas totais, AT, taninos hidrolisáveis totais, THT, e taninos condensados totais, TCT) e a capacidade antioxidante in vitro pelos métodos ORAC e HORAC. Como referido na bibliografia, as framboesas analisadas são abundantes em compostos fenólicos, sobretudo antocianinas e elagitaninos. A aplicação da espetrometria de massa MALDI-TOF possibilitou uma obtenção rápida de espetros, tendo sido identificados 33 compostos: antocianinas, sobretudo derivados da cianidina e da pelargonidina, sanguiina H-6 e Lambertianina C, ácido elágico e derivados e derivados da quercetina, entre outros, e dos ácidos quínico e cítrico. As análises HPLC-ESI-MS/MS num equipamento do tipo triplo quadrupolo possibilitaram a identificação de maioria destes compostos e ainda de ácidos hidroxicinâmicos, de outros taninos hidrolisáveis e do ácido málico. A quantificação das amostras foi realizada por HPLC-DAD. A comparação da composição fenólica de framboesas dos 4 genótipos possibilitou a escolha da Amira para os ensaios biológicos. O extrato de Rubus idaeus L. selecionado mostrou atividade antioxidante elevada em testes in vitro, não só de avaliação de atividade antioxidante química, testes ORAC e HORAC, mas igualmente em ensaios que avaliam o mesmo efeito em meio celular como o CAC, feito em células Caco-2, e na modulação do oxidative burst dos neutrófilos. O extrato [15 mg Fenóis Totais (EAG).Kg-1] quando usado no modelo de inflamação aguda de edema induzido pela carragenina, em rato, mostrou ter um elevado efeito anti-inflamatório mas só quando foi administrado via intraperitoneal (i.p.). No modelo de inflamação crónica de artrite reumatoide (AR) induzida pelo colagénio II, o mesmo extrato administrado i.p. mas também por via oral (p.o.) mostrou ter uma potente atividade anti-inflamatória diminuindo o edema, os danos na cartilagem, o inchaço dos tecidos moles e a reabsorção óssea e reduzindo marcadamente a expressão de iNOS e de COX-2, demostrando uma proteção significativa na progressão da AR. No ENIH, pretendeu-se estudar o efeito do consumo de 150 g de framboesas, diariamente, durante 3 semanas, no stresse pós-prandial metabólico, oxidativo e inflamatório, induzido por uma refeição hipercalórica rica em gordura e açúcar (RRGA), em voluntários saudáveis. Os resultados mostraram que o consumo de framboesas evitou o decréscimo pronunciado dos níveis de HDL e, em parte, a oxidação das LDL provocados pela RRGA, diminuiu significativamente os valores basais de LDLox dos voluntários e atenuou o aumento de valor de TNF-α e de IL-6 provocados pela ingestão da mesma refeição. Os nossos resultados sugerem que a framboesa e o seu extrato fenólico podem atenuar, em certa medida, o stresse metabólico, oxidativo e inflamatório e, como tal, ter um papel importante de proteção na saúde humana. Visando dar um contributo para o desenvolvimento de uma alegação de saúde sobre framboesa ou extratos desta, ricos em compostos fenólicos, foram analisados e discutidos requisitos legais vigentes e orientações da Autoridade Europeia de Segurança dos Alimentos respeitantes à fundamentação científica de alegações de saúde na UE. Foram ainda identificadas as alegações de saúde autorizadas suscetíveis de serem usadas por frutos ou extratos de Rubus idaeus L.Chronic diseases, currently the leading cause of death around the world, have increased dramatically result of changes in lifestyle, including physical inactivity, high levels of stress and changes in diet. According to the WHO these premature deaths are preventable. The promotion of healthy eating habits, such as increased intake of fruit and vegetables, the main source of bioactive (poly)phenols, is a way to protect the health of populations. The red raspberry fruit (Rubus idaeus L.) is a recent production in Portugal. This red fruit is a dietary source of bioactive compounds, including phenolic compounds, anthocyanins and ellagitannins, which have demonstrated biological activity, antioxidant, anti-inflammatory, antimicrobial, antiproliferative and anti-cancer, among others. There are some studies on the physiological effects of these fruits but few have been conducted in animals and humans. Taking this into consideration, our study aimed to achieve a chemical and biological characterization of Rubus idaeus L. fruits produced in our country in order to contribute to the development of a health claim. Thus, some fruit samples of Rubus idaeus L. from Odemira area in the Alentejo Coast were characterized chemically: 4 genotypes, produced between 2010 and 2013; an extract produced from raspberries harvested in 2010 which was used in the evaluation of the biological activity (antioxidant activity and anti-inflammatory) in vitro and in vivo in cell and animal models; a sample of ripe Amira raspberries ingested by healthy volunteers in a study of nutritional intervention (ENIH). The phenolic characterization was performed on extracts (methanol and acetone) by chromatographic and mass spectrometric techniques (HPLC-DAD and LC-DAD-MS/MS, MALDI-TOF-MS) and spectrophotometric (total phenols, FT, total flavonoids, FLT, anthocyanins, AT, total hydrolysable tannins, THT, and condensed tannins total, TCT) and in vitro antioxidant capacity by ORAC and HORAC methods. As mentioned in the literature, the raspberries analysed were abundant in phenolic compounds, especially anthocyanins and ellagitannins. The application of MALDI-TOF mass spectrometry has enabled a rapid spectra realization. 33 compounds were identified: anthocyanins, particularly derivatives of cyanidin and pelargonidin, sanguiina H-6 and lambertianina C, ellagic acid and derivatives and derivatives of quercetin, among others, and quinic acid and citric acid. HPLC-ESI-MS/MS analyses on a triple quadrupole equipment allowed the identification of most of those compounds and the further identification of one hydroxycinnamic acid, other hydrolyzable tannins and malic acid. The quantification of the samples was carried out by HPLC-DAD. Phenolic composition comparison of the 4 raspberries genotypes allowed the choice of Amira for biological assays. The selected Rubus idaeus L. extract showed a high antioxidant activity in vitro tests, not only regarding the chemical antioxidant activity, HORAC ORAC tests, but also in assays that evaluate the same effect on a cellular environment as the CAC, realized in Caco-2 cells, and in the neutrophils oxidative burst modulation. The extract [15 mg of Total Phenols (GAE).Kg-1], when used in the acute inflammatory model of carrageenin-induced edema in rat, was shown to have a high anti-inflammatory effect but only when it was administered i.p. In the chronic inflammation rheumatoid arthritis (RA) model induced by collagen II, the same extract administered i.p. but also orally (p.o.) showed a potent anti-inflammatory activity, decreasing the edema, cartilage damage, soft tissue swelling and bone resorption, and markedly reducing the expression of iNOS and COX2, demonstrating a significant protection in the progression of RA. In ENIH it was intended to study the effect of the daily consumption of 150 g raspberries, for 3 weeks, on postprandial metabolic, oxidative and inflammatory stress, induced by a hypercaloric meal rich in fat and sugar (RRGA) in healthy volunteers. The results showed that consumption of raspberries avoided pronounced decrease in HDL levels and, in part, the LDL oxidation induced by RRGA significantly decreased the oxLDL volunteers baseline and attenuated the increase in TNF-α and IL-6 values caused by the ingestion of that meal. Our results suggest that phenol and its raspberry extract can mitigate to some extent the metabolic, oxidative and inflammatory stress and, as such, could play an important role in human health protection. Aiming to contribute to the development of a health claim on raspberry fruits or on their extracts rich in phenolic compounds, legal requirements and EFSA guidelines concerning the scientific basis of health claims on foods in the EU were analyzed and discussed. There were also identified the authorized health claims likely to be used on Rubus idaeus L. fruits or extracts