Hematopoiesis in transgenic rats overexpressing neuronal adenosine A2A receptors

Tese de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015A hematopoiese é um processo contínuo pelo qual são geradas as células do sangue, a partir das células estaminais hematopoiéticas. Nos adultos, ocorre na medula óssea e a sua regulação envolve vários factores e múltiplas vias de sinalização. Duas grandes linhagens derivam das células estaminais hematopoiéticas: a linhagem mielóide, onde se inserem os monócitos/macrófagos, plaquetas, glóbulos vermelhos e granulócitos (eosinófilos, basófilos e neutrófilos), e a linhagem linfóide, composta pelas células B, células T e células NK. Os glucocorticóides são uma classe de hormonas esteróides responsáveis por um vasto leque de acções no organismo, entre as quais proliferação celular, resposta a stress e processos cognitivos. Têm um efeito evidente nas várias células hematopoiéticas, afectando a sua proliferação, diferenciação e migração entre a medula óssea e a circulação sanguínea. De forma geral, os glucocorticóides promovem a proliferação de células mielóides e diminuem o número de linfócitos, em circulação. Exposição a glucocorticóides promove um aumento dos níveis de neutrófilos em circulação e atrasa a sua apoptose, promovendo ainda um aumento de células eritróides. Tratamento com glucocorticóides está também correlacionado com um aumento na função fagocitária dos macrófagos. Por outro lado, a linhagem linfóide é negativamente influenciada pelos glucocorticóides, sendo que exposição a estas hormonas promove uma redução no número de células T e B em circulação. Os níveis de glucocorticóides em circulação estão sujeitos a oscilações diárias, que se traduzem num robusto ritmo circadiano. Estas oscilações influenciam vários factores envolvidos na regulação das células estaminais hematopoiéticas. Pensa-se que altos níveis de corticosterona, o principal glucocorticóide em roedores, induzem apoptose de células estaminais hematopoiéticas e reduzem a sua capacidade de repopulação da medula óssea, enquanto baixos níveis de corticosterona induzem a proliferação das mesmas células. Factores como CXCL12 e Notch1 estão envolvidos na migração e diferenciação das células estaminais hematopoiéticas, respectivamente, e ambos encontram-se sob influência do ritmo circadiano dos glucocorticóides. Concentrações anormais destes factores podem comprometer a hematopoiese, sugerindo que as oscilações diárias de glucocorticóides desempenham um papel importante na regulação das células hematopoiéticas. Recentemente, foi demonstrado que a sobreexpressão neuronal de receptores A2A de adenosina, uma característica de envelhecimento cerebral e neurodegeneração, é suficiente para gerar alterações no eixo hipotálamo-hipófise-adrenais, levando a uma disfunção no ritmo circadiano dos níveis plasmáticos de corticosterona, em ratos. Este receptor está envolvido em funções motoras, desordens de ansiedade, stress, envelhecimento e doenças degenerativas, como o Alzheimer. Durante o normal envelhecimento do cérebro há um aumento dos receptores A2A no hipocampo. A mesma tendência é encontrada nos pacientes de Alzheimer e pensa-se que este receptor é necessário para a neurotoxicidade das placas de amilóide beta, uma característica desta doença. As consequências da sobreexpressão neuronal de A2AR no cérebro e em processos neurológicos têm vindo a ser estudadas. Contudo, as consequências desta sobre expressão para todo o organismo, mais precisamente para o sistema hematopoiético, são actualmente desconhecidas. Usando um modelo transgénico, Tg(CaMKII-hA2AR), foi possível estudar o papel da sobre expressão neuronal de A2AR na hematopoiese e na regulação das células hematopoiéticas, através da acção de glucocorticóides. Os ratos transgénicos apresentam uma sobre expressão neuronal de A2AR, o que induz, entre outros efeitos, uma disrupção no ritmo circadiano dos níveis de corticosterona. Ao longo do estudo, vários parâmetros hematopoiéticos foram abordados. Usando um ensaio de formação de colónias em meio semi-sólido, avaliámos tanto o número como a capacidade de diferenciação das células hematopoiéticas progenitoras de ratos transgénicos, em comparação com ratos wild-type. Diferenças a nível das várias populações de células hematopoiéticas foram avaliadas recorrendo a citometria de fluxo. Foram ainda exploradas alterações a nível do microambiente vascular da medula óssea, quer por observação de vasos sanguíneos quer por quantificação génica de diversos factores, recorrendo a técnicas de imuno-histoquímica, imunofluorescência e RT-PCR. Ratos transgénicos apresentam um aumento nos números de células totais da medula óssea femoral. Este aumento celular pode ser resultado de uma alteração na composição celular da medula óssea, uma vez que foi observado um aumento dos números de células mielóides. A sobre expressão neuronal de A2AR parece beneficiar a linhagem mielóide e modular o microambiente vascular da medula. Apesar de não existir uma diferença nos seus números totais, as células hematopoiéticas progenitoras de ratos transgénicos geraram mais colónias percursoras de granulócitos e de granulócitos/monócitos, revelando uma preferência pela linhagem mielóide. Os resultados de citometria de fluxo acompanharam esta tendência, revelando um aumento do número de células CD11b+, um marcador de células mielóides. Também os resultados de RT-PCR revelaram um aumento da expressão relativa de Csf1, um factor estimulante de colónias de macrófagos. A nível do microambiente vascular da medula óssea, foi observado um aumento dos vasos sanguíneos positivos para CD105, um marcador endotelial, apesar da expressão de factores envolvidos em angiogénese, se encontrar diminuída nos ratos transgénicos. A sobre expressão neuronal de A2AR parece não ter nenhuma influência sobre o número de megacariócitos, uma vez que a marcação com vWF e a expressão relativa de trombopoietina não revelaram diferenças entre os ratos transgénicos e wild-type. Tanto as disfunções na via de sinalização dos glucocorticóides e a sobre expressão neuronal de A2AR estão relacionadas com processos neurodegenerativos e envelhecimento cerebral. Para além deste facto, são usados frequentemente glucocorticóides sintéticos na clínica, como tratamento de várias doenças, tornando importante o estudo destes receptores e das suas acções em todo o organismo. O nosso trabalho sugere que a sobre expressão neuronal de A2AR tem um papel na hematopoiese, através dos efeitos de glucocorticóides, promovendo uma alteração na composição celular da medula óssea e no seu microambiente vascular. Em conjunto, os resultados apresentados contribuem para um maior conhecimento sobre o papel da sobre expressão neuronal de A2AR e dos glucocorticóides na regulação hematopoiética.Hematopoiesis is the continuous process of blood cells generation from hematopoietic stem cells. Its regulation involves multiple pathways and regulatory signals. Glucocorticoids, a class of steroid hormones responsible for a wide range of effects in the organism, are known to have well-defined effects in hematopoietic cells, affecting their proliferation, differentiation and function. It was recently shown that neuronal overexpression of the adenosine A2A receptor – a characteristic of aging and neurodegeneration - induces impairments in glucocorticoid receptor actions. Ultimately, this leads to dysfunctions in the hypothalamic-pituitary-adrenal axis, caused by obliteration of the circadian rhythm of plasma glucocorticoids in rats. However, the consequence of this disruption to the whole organism, more precisely to the hematopoietic system, remains unknown. Using transgenic rats with neuronal overexpression of A2AR it was possible to explore the role of this overexpression in hematopoiesis and in hematopoietic cells regulation, via glucocorticoid actions. We evaluated several hematopoietic parameters, such as hematopoietic progenitor cells’ differentiation capacity, differences in hematopoietic cells and in the bone marrow vascular niche. Our main finding is that neuronal overexpression of A2AR triggers a shift in the bone marrow cellular composition, by favouring myeloid cell differentiation. Furthermore, neuronal overexpression of A2AR seems to promote changes in the bone marrow vascular niche, increasing the number of CD105+ blood vessels and modulating the expression of angiocrine factors. Together, these results contribute to unravel the role of neuronal overexpression of A2AR and glucocorticoids in hematopoiesis