Deciphering novel targets for antifungal drugs: ionic liquids as triggers of alternative pathways for cell wall integrity in filamentous fungi

Tese de mestrado, Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015Os fungos são microorganismos eucarióticos, ubíquos. São capazes de crescer sob a forma de filamentos tubulares denominados hifas, podendo também assumir-se como seres unicelulares, denominando-se leveduras. Alguns podem alternar entre o crescimento micelial ou leveduriforme, denominando-se fungos dimórficos. Sendo heterotróficos, os fungos excretam enzimas extracelulares que degradam compostos complexos de forma a absorver os nutrientes necessários. São também importantes agentes infecciosos. As infecções causadas pelos fungos (i.e. micoses) são ora superficiais (afectam pele, unhas, cabelo ou mucosas) ou sistémicas (afectam camadas internas da pele, ou outros órgãos). As infecções do tipo sistémico são extremamente graves, especialmente para indivíduos que sofrem de desregulação imunitária (ex. pacientes de VIH/SIDA ou sujeitos a quimioterapia), apresentando taxas de mortalidade de ca. 50% mesmo quando existe um diagnóstico precoce. Largamente negligenciadas no passado, estas infecções são hoje em dia consideradas um problema de saúde pública global. Este problema torna-se ainda mais crítico, já que quer o número de estirpes infecciosas, a maioria resistente aos antifúngicos existentes, e de pacientes imunocomprometidos aumenta gradualmente. Para além disso, existem poucas terapias disponíveis: (1) polienos (aumentam a permeabilidade da membrana celular através da ligação ao ergosterol); (2) azóis (inibem a síntese do ergosterol); e (3) equinocandinas (inibem a síntese de glucanos β-1,3). Atualmente estas infecções matam, por ano, mais de 1.5 milhões de pessoas. O ritmo de desenvolvimento de novos antifúngicos é insuficiente já que os últimos entraram no uso clínico nos anos 80. É, portanto, urgente quer o desenvolvimento de novas terapias, quer a melhoria das existentes. O verdadeiro desafio é compreender melhor a biologia dos fungos, identificando novos alvos específicos que afetam o ciclo infeccioso ou os seus mecanismos de resistência. Aspergillus nidulans, reconhecido como organismo modelo (introduzido por Pontecorvo no início da década de 50) em estudos genéticos e bioquímicos, é filogeneticamente próximo de vários fungos patogénicos, portanto um adequado modelo para responder a este desafio. Como maiores objectivos deste trabalho estabelecemos a identificação de elementos da via de integridade da parede celular (CWI), dos genes regulados por ela, e dos precursores da via biosintética dos esfingolípidos que actuam como mensageiros secundários na sua activação. A via de CWI assegura a transdução de sinal através de uma cascata fosforilativa, regulando a expressão de genes que codificam enzimas envolvidas na síntese/remodelação de componentes da parede celular. É portanto um alvo potencial para o desenvolvimento de novas terapias antifúngicas. Estudos anteriores demonstraram que a suplementação do meio de cultura com 80% da concentração mínima inibitória (MIC) do sal líquido cloreto de dodecilfosfónio ([P 4 4 4 12]Cl) (i.e. líquido iónico) conduz a aumento na expressão de genes que codificam ou são regulados pela via de CWI em A. nidulans, suportando a existência de uma via desconhecida neste fungo. Concomitantemente, a expressão de genes que codificam para a síntese de esfingolípidos é afectada de forma que sugere a acumulação de alguns precursores. Com base nestes dados, este líquido iónico foi usado como estratégia para responder aos objectivos acima descritos. Culturas de A. nidulans foram expostas a 80% do MIC do líquido iónico, durante 4 horas. Como controlo positivo recorremos a um antifúngico da classe das equinocandinas (caspofungina, 80% da MIC), cujo mecanismo de acção conduz à ativação de uma via de CWI já parcialmente caraterizada em A. nidulans. Para identificar os elementos que sofrem fosforilação na via de CWI ativada pelo [P 4 4 4 12]Cl, recorremos ao estudo do fosfoproteoma acumulado de forma diferencial (eletroforese em gel bidimensional, 2DE) nesta condição em comparação com os controlos, quer positivo (caspofungina) quer negativo (ausência de qualquer stress). Este estudo, foi complementado pela análise da expressão diferencial de genes que codificam, ou são regulados, pela via de CWI, recorrendo a qRT-PCR. Para avaliar a hipótese de precursores da via biossintética dos esfingolípidos atuarem como ativadores da via de CWI, a expressão diferencial dos genes que codificam na sua biossíntese foi analisada. A acumulação dos precursores no micélio do fungo foi investigada por cromatografia líquida de elevada performance (HPLC). O líquido iónico activou claramente a expressão de genes que codificam na via de CWI. Contudo o mpkA (activador do factor de transcrição rlmA) não foi expresso de forma diferencial. A análise da expressão diferencial de genes que codificam enzimas de biossíntese ou remodelação da parede celular mostrou a existência de vários genes potencialmente regulados pela via de CWI activada pelo [P 4 4 4 12]Cl. Tal inclui genes envolvidos na síntese da quitina e glucanos, ou na sua degradação, entre outros. Estas observações suportam a hipótese de que o líquido iónico activa uma via ainda não totalmente caracterizada em A. nidulans. De referir que a maioria dos estudos até à data, recorreram à caraterização de genes homólogos aos da via de CWI em Saccharomyces cerevisae. Em oposição, após suplementação do meio de cultura com 80% da MIC de caspofungina (controlo positivo), e após 4 horas, a maioria os genes envolvidos na via de CWI (incluindo os regulados) não mostraram expressão diferencial, assim como o fksA; codifica para a enzima alvo do antifúngico. O aumento da expressão do mpkA constitui uma excepção, mas o seu envolvimento noutros mecanismos de defesa à caspofungina é conhecido. Entre os polipéptidos acumulados no fosfoproteoma de forma diferencial na presença do líquido iónico em comparação com os controlos, não detetámos, até à data, quais os que foram fosforilados durante a activação da via de CWI. Contudo, o seu estudo detalhado está ainda a decorrer. De qualquer forma, as proteínas já identificadas revelam alguns mecanismos de resposta ao stress causado pelo líquido iónico, nomeadamente alterações na translação e no crescimento apical das hifas, entre outros. De salientar, também, a identificação de proteínas envolvidas em mecanismos de sinalização dependente do [Ca2+] que regulam a via de CWI. Por outro lado, os polipéptidos acumulados no fosfoproteoma de forma diferencial na presença do caspofungina (que não ativou os genes da via de CWI ou regulados por esta) em comparação com o controlo negativo, revelam alterações em vias similares às afetadas pelo líquido iónico. Contudo, as proteínas foram identificadas em spots diferentes o que reforça uma regulação diferencial das mesmas, consistente com o facto de este químico possuir um mecanismo de acção distinto do líquido iónico. É necessário optimizar as condições de utilização da caspofungina como controlo positivo e/ou recorrer a outro controlo. Os dados de expressão diferencial de genes que codificam enzimas envolvidas na síntese de componentes da membrana, incluindo esfingolípidos na presença de [P 4 4 4 12]Cl ou de caspofungina, em comparação com o controlo negativo, reforçam que apenas o líquido iónico, nas condições testadas, ativou a via de CWI. Nesta condição, verificamos aumento da expressão da maioria dos genes que codificam na síntese de esfingolípidos, com excepção de barA e lagA. Estes resultados, suportam a acumulação de precursores desta via após 4 horas de exposição ao líquido iónico. De facto, as análises cromatográficas, demonstraram a acumulação de esfingosina e provavelmente, embora de forma menos evidente, de outra base esfingoide não caracterizada. Em concordância, com a incapacidade da caspofungina alterar, nas condições testadas, a expressão de genes envolvidos na biossíntese de esfingolípidos, não detetamos a acumulação de quaisquer precursores. Em suma, a expressão dos genes que codificam na biossíntese de esfingolípidos e a acumulação significativa de esfingosina em meio suplementado com o líquido iónico, suportam a hipótese de um papel regulador da esfingosina, provavelmente como ativador da via de CWI em A. Nidulans Em conclusão, os dados obtidos nesta tese reforçam a utilidade do stress imposto pelo líquido iónico para activar uma via desconhecida de CWI. Esta estratégia de suplementação do meio de cultura do fungo, permite estudar os elementos que compõem a via de CWI, ou que por ela são regulados, assim como elementos desconhecidos da via de biossíntese de esfingolípidos que provavelmente a regulam. O estudo sugere o papel potencialmente regulador da esfingosina; uma nova hipótese que merece estudo mais detalhado. Assim, os dados obtidos reforçam e completam as observações iniciais da nossa equipa. Alguns aspectos desta tese requerem ainda análise detalhada, mas as metodologias já optimizadas, em particular a de fosfoproteómica, permitiram estabelecer conhecimentos sólidos para estudos futuros.Several filamentous fungi are emerging as critical human-pathogens, provoking highly mortal invasive infections. The current antifungal therapies are inadequate to fight this global threat. The challenge of developing novel antifungal therapies requires a better understanding of specific salvage mechanisms that fungi use to circumvent cell wall damages caused by chemicals. Initial observations focus on the expression of a limited number of genes, suggested the capacity of some specific liquid salts to activate an uncharacterized cell wall integrity pathway, probably under the positive regulation of specific sphingoid bases. In the present thesis these initial hypothesis were addressed in greater detail, focusing on a specific phosphonium-based ionic liquid, [P 4 4 4 12]Cl. Differential analysis of genes coding in the CWI pathway or regulated by it, as well as of genes coding in the biosynthesis of sphingolipids, were undertaken. The diversity of sphingoid bases accumulating during stress imposition was characterized. To complement these analyses, the differential phosphoproteomes were also analyzed. In general, the data support the capacity of ionic liquid to activate an uncharacterized CWI pathway and to lead to the accumulation of sphingosine. Sphingosine is likely acting as second messenger in the activation of the salvage CWI pathway. This is an extremely exciting hypothesis that deserves further analysis. Proteins showing differential accumulation and phosphorylation, support distinct mechanisms of action of the ionic liquid compared to caspofungin, notwithstanding the last was unable, at the conditions tested, to impose severe cell wall damage. Future analyses will be targeted to identify the differential phosphorylated peptides under the imposition of the ionic liquid stress. Moreover, novel assays will be undertaken using both wild type and mutants impaired in the biosynthesis of sphingolipids, exposed to either the ionic liquid or sphingosine, to unravel the cross-talk mechanism between the two pathways