Impact of seawater acidification in starfish regeneration: a proteomic approach

Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015Since the start of the industrial revolution (XVIII century), atmospheric levels of carbon dioxide (CO2) have been rising at a far greater rate than previously experienced, increasing CO2 dissolved in seawater. This process is recognized as ocean acidification and can severely damage calcifying organisms. Since echinoderms have an endoskeleton composed of magnesium calcite, they are predicted to be a sensitive taxa affected by this acidic environment. Taking into account that some species of this filo have a faster regeneration capacity under low pH, analysis of the proteome represents a powerful tool to examine these physiological trait at a molecular level. Trying to strengthen this work on ocean acidification effects, we studied Asterias rubens’ behaviour by observing their preference in choosing a leading arm when submitted to different regeneration time-points (non-regeneration and regeneration after 1, 4, 9 and 14 days) and at two pH environments (control (CpH) – 8.1 and low (LpH) – 7.7). It was concluded that they do not have a preference leading arm before ablation in both pH environments. Although, one day after ablation they drastically decrease the use of the wounded arms, as expected, while the non-amputated arms did not suffer any changes. Furthermore, after nine days subjected to these conditions, it seems that sea stars recovered completely the movement of the amputated arms. Asterosaponins search was also a vital part of this work, since they are known for having important functions in sea stars. We observed that two of the nine asterosaponins detected in the control pH were also detected in low pH samples, and that their concentration decreased, suggesting that acidic pH may alter their biosynthesis. Proteins from both cell-free coelomic fluid (CFF) and radial nerve cord (RNC) were extracted, digested and further analyzed by nano LC-MS/MS. We were able to identify 298 proteins, being 81% of all proteins identified differentially expressed. A surprising finding was the almost absence of stress proteins in an acidic pH environment. In this work, we propose a correlation between an acidic environment and asterosaponins’ biological effects. The decline in diversity and amount of these biomolecules can be caused by already known decreases in respiratory rate and cholesterol absorption. Although, asterosaponins might have positive effects in predation and reproduction. The detected increase in vitellogenin expression seems to be associated with the amplified spawning event induced by the low levels of asterosaponins at acidic pH, thereby also enhancing reproduction.Desde o início da revolução industrial (século 18) que os níveis atmosféricos de dióxido de carbono (CO2) têm aumentado a um ritmo nunca antes registado (de 280ppm para 380ppm, e espera-se que duplique no final do século), essencialmente devido à emissão de gases com efeito de estufa resultantes de atividades humanas. Como consequência, a concentração de CO2 dissolvido nos oceanos também aumenta, e por sua vez, também a concentração de iões hidrogénio e iões bicarbonato, conduzindo a uma diminuição de pH e de iões carbonato. Este conjunto de reações é designado por acidificação dos oceanos, e pode danificar seriamente o funcionamento de organismos marinhos que de alguma forma utilizam o processo de biocalcificação na sua estrutura corporal. Os equinodermes possuem um endosqueleto composto por calcite de magnésio, têm uma extraordinária capacidade de regeneração, mas também são osmoconformadores. Isto significa que o fluido celómico (CF) que preenche a cavidade corporal é muito semelhante, a nível de composição iónica, ao ambiente externo a que está submetido. Embora também muito idêntico, o pH do fluido celómico é geralmente 0.11-0.58 unidades mais baixo que o pH do exterior, devido a taxas de difusão de CO2 mais ou menos lentas, que podem aumentar ou reduzir a concentração de dióxido de carbono no CF, respetivamente. Por estas razões prevê-se que os equinodermes sejam um taxa sensível a ambientes ácidos. Apesar de se esperar que todas as espécies sejam afetadas de forma negativa, é do conhecimento científico que algumas espécies deste filo crescem e desenvolvem-se mais depressa quando expostas a pH ácido, enquanto outras apresentam diminuição de metabolismo ou redução da expressão proteica global. Considerando a diversidade incongruente de resultados publicados, e tendo a estrela-do-mar comum A. rubens como espécie-alvo, realizámos análises de expressão proteica para estudar estas observações fisiológicas de uma perspetiva molecular. Por forma a ter um estudo mais completo sobre o efeito da acidificação nesta espécie, observámos estrelas-do-mar sob diferentes tempos de regeneração (não-amputação e amputação após 1 dia, 4, 9 e 14) submetidas a dois pHs (controlo (CpH) – 8.1 e ácido (LpH) – 7.7), com o propósito de determinar com que braço preferencialmente elas iniciavam a deslocação. Os braços escolhidos para amputação foram os mais próximos à madreporita. As estrelas-do-mar não apresentaram preferência no braço ‘líder’ antes de amputadas e sob CpH, o que não é consistente com resultados já publicados. No entanto, como esperado, os braços amputados apresentaram uma diminuição do número de movimentos um dia após a regeneração ser imposta, enquanto o número de movimentos dos braços não-amputados permaneceu igual. Após nove dias os movimentos dos braços amputados foram restabelecidos para os valores iniciais (sem amputação), e por isso considerámos que as estrelas recuperaram o movimento normal dos braços. É vantajoso para a estrela-do-mar que este movimento seja restabelecido o mais rapidamente possível, para que possa, entre outros, alimentar-se e/ou fugir de possíveis predadores. Para estudar os fatores moleculares que possam estar envolvidos em resposta a uma futura diminuição do pH dos oceanos, foram recolhidos dois tipos de amostra: fluido celómico (dois pHs e 15 dias pós-amputação), e nervo radial (RNC; dois pHs e não-amputação; dois pHs e 15 dias pós-amputação). O CF foi centrifugado para que fossem retirados os coelomócitos, designando-se desta forma fluido celómico livre de células (CFF). Este fluido foi submetido a centrifugação e ultrafiltração para separar a fração de alta massa molecular (proteínas) da fração de baixa massa molecular. Esta última contém asterosaponinas, moléculas que são conhecidas por terem funções importantes a nível de sinalização química mas também a nível digestivo e reprodutivo, e que por isso considerámos essenciais neste estudo. Esta fração foi então sujeita a extração de fase sólida (SPE) com diferentes eluições de acetonitrilo e ácido fórmico para isolamento das asterosaponinas, e posteriormente analisadas por ESI-MS. Os dados foram adquiridos por um espectrofotómetro linear ion trap mass Thermo Finnigan LTQ, controlado pelo software Xcalibur v 2.0, também usado na análise dos espectros resultantes da leitura das amostras. Todas as asterosaponinas investigadas estavam presentes no pH controlo, mas apenas duas delas foram detetadas em estrelas-do-mar submetidas a pH ácido. Para além disto, as suas concentrações diminuíram em pH ácido. Tendo em conta que a A. rubens apresenta um baixa taxa de respiração após 27 dias exposta a pH 7.7 do que quando submetida a pH 8.1, podemos assumir que este decréscimo irá alterar a disponibilidade de ATP, e consequentemente comprometer a biossíntese de asterosaponinas. Por sua vez, a diminuição destas biomoléculas poderá ter efeitos negativos a nível digestivo, através da redução da absorção de colesterol, mas poderá também ter efeitos positivos ao nível da predação. As proteínas do CFF foram extraídas e precipitadas com recurso a ácido tricloroacético e beta-mercaptoetanol, enquanto as proteínas do RNC foram extraídas e precipitadas recorrendo a azoto líquido e a um buffer suplementado com SDS, Tris-HCl, DTT, um cocktail anti-protease e PMSF. A quantificação das proteínas do CFF e RNC foi feita com recurso ao QuantiPro BCA Assay KIT 0.5-30μg/mL protein, e a digestão, embora diferente, teve como base o uso de redutores de pontes persulfureto (DTT e TCEP), iodoacetamida para alquilação das cisteínas e tripsina para quebrar a proteína em péptidos. As amostras digeridas de ambos os tecidos foram analisadas por nano LC-MS/MS. Foram identificadas 213 proteínas no RNC, mas apenas uma estava presente em todas as condições estudadas. Por esta razão, podemos concluir que o procedimento experimental deve ser otimizado. A análise do CFF permitiu identificar 298 proteínas, das quais 19% eram comuns às duas condições de pH. De acordo com estes resultados, 81% de todas as proteínas identificadas estavam diferencialmente expressas. Comuns a ambas as condições de pH, e como esperado, foram detetadas actinas, tubulinas e ubiquitinas. A quantificação realizada permitiu observar um aumento de expressão significativo apenas em 2 proteínas no pH ácido: alfa-tubulina e vitellogenina 1. A primeira está envolvida na formação do citoesqueleto, e por isso, será importante numa fase de rápida proliferação celular. A segunda proteína é responsável pelo transporte de lípidos para os oócitos, e o seu aumento de expressão parece aumentar o número de eventos de desova em estrelas-do-mar. Os baixos níveis de asterosaponinas presentes em pH ácido também parecem favorecer este acontecimento, aumentando desta forma, o sucesso reprodutivo. Com base em estudos recentes realizados em corais e em zooplâncton, previa-se um aumento na expressão de proteínas de stress em condições de pH ácido. No entanto, no presente estudo, as estrelas-do-mar submetidas a esta condição de pH, exibiram apenas uma proteína de stress. Para melhor compreensão dos efeitos da acidificação dos oceanos em cada uma das proteínas aqui identificas, será necessário realizar estudos mais detalhados para avaliar o impacto biológico da expressão proteica diferencial que observámos