Identification of biomarkers in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa fatal e de rápida progressão, caracterizada pela degeneração dos neurónios motores do córtex motor, tronco cerebral e medula espinhal. A maioria dos doentes desenvolve ELA entre os 40 e 70 anos de idade e o diagnóstico baseia-se na observação clínica e testes neurofisiológicos. Os principais sintomas são fraqueza e paralisia progressiva de todos os músculos. Entre 90-95% dos casos de ELA são esporádicos (não têm base genética) e os restantes 5-10% dos casos são familiares e de transmissão autossómica dominante. De entre as mutações características de ELA familiar, cerca de 20% ocorrem no gene que codifica para a enzima Cu/Zn superóxido dismutase 1 (SOD1). Uma vez alterada a actividade enzimática da SOD1, ocorre um aumento dos níveis de anião superóxido, o que contribui para o stresse oxidativo celular. De facto, os eritrócitos de doentes com ELA apresentam mutações na SOD1, às quais acresce desregulação da actividade enzimática do glutatião peroxidase, glutatião reductase e desidrogenase da glucose-6-fosfato. A etiologia da doença é ainda desconhecida mas o stresse oxidativo, disfunções no transporte axonal e nas mitocôndrias, excitotoxicidade induzida por glutamato e neuroinflamação são alguns dos mecanismos apontados para explicar a degeneração dos neurónios motores. Actualmente, falta ainda esclarecer três questões de máxima importância em respeito a esta incapacitante doença: compreender a sua etiologia, identificar biomarcadores moleculares que possam ajudar no diagnóstico e descobrir uma terapêutica efectiva. Os glóbulos vermelhos transportam oxigénio dos pulmões para os tecidos e dióxido carbono destes para os pulmões, contribuindo também para a regulação da viscosidade sanguínea através da captação e libertação de agentes vasoactivos, como o monóxido de azoto (NO), e da modulação das propriedades mecânicas. O NO é uma molécula sinalizadora produzida no sistema nervoso central que modula a actividade neurológica e o fluxo sanguíneo. Uma vez que participa no stresse oxidativo, o NO medeia mecanismos de neuroprotecção e neurotoxicidade. Como factor neurotóxico, promove o stresse oxidativo através da sua reacção com o anião superóxido para formar peroxinitrito e, consequentemente, outros metabolitos reactivos. Estas espécies reactivas de monóxido de azoto (RNOS) podem induzir a quebra de cadeias de DNA, peroxidação lipídica, nitração e nitrosilação de proteínas, disfunção mitocondrial e apoptose, contribuindo para os processos de neuroinflamação, descritos na ELA. Uma vez sintetizado pela enzima endotelial constitutiva, denominada sintase do monóxido de azoto (eNOS), o NO pode difundir para as células musculares lisas adjacentes ou para o lúmen vascular. Uma vez no músculo liso, leva a relaxamento muscular. Quando difundido para o lúmen vascular, o NO é capturado pelos glóbulos vermelhos, que o armazenam e libertam, regulando assim a agregação e deformabilidade eritrocitárias, afectando a capacidade que estas células têm em circular pelos capilares. O influxo de NO para o eritrócito faz-se inicialmente por ligação à proteína de membrana band-3 e depende do grau de fosforilação da mesma. Uma vez dentro do glóbulo vermelho, o NO conjuga-se com a hemoglobina, dependendo do seu grau de desnaturação, e com oxigénio, induzindo a produção de metahemoglobina. É da combinação do NO com as diferentes moléculas e proteínas existentes no eritrócito que resultam o S-nitrosoglutatião (GSNO), nitritos e nitratos, compostos relativamente inertes. O GSNO é produzido pela conjugação do glutatião com o NO dentro do eritrócito e funciona como reservatório, transportador, dador e mediador endógeno de NO, sendo considerado uma molécula antioxidante. Por sua vez, os nitritos e nitratos resultam essencialmente da decomposição dos peroxinitritos, mas também da ligação do NO a oxigénio e hemoglobina. A acetilcolinesterase (AChE) está localizada na membrana externa dos eritrócitos, onde é conhecida como marcador da integridade de membrana dos mesmos, uma vez que ajuda a manter a normal circulação sanguínea e oxigenação dos tecidos. A acetilcolina (ACh) não-neuronal, substracto natural da AChE, poder ser considerada um modulador das propriedades hemoreológicas dos eritrócitos e uma molécula sinalizadora que contribui para a manutenção da homeostasia celular, tendo um papel central na microvasculatura. A ACh existe na circulação sanguínea e actua como efector da vasodilatação, uma vez que estimula a produção de NO pela eNOS, dependendo do grau de integridade da membrana. Desta forma, a ACh também participa na mobilização de NO e seus derivados no eritrócito. Para tal, a ligação da ACh plasmática à AChE da membrana do glóbulo vermelho inicia um mecanismo de transdução de sinal que envolve as proteínas Gi e band-3 de membrana, estimulando o efluxo de NO do eritrócito e a mobilização de nitritos e nitratos. Como mencionado anteriormente, os eritrócitos de doentes com ELA apresentam um excesso de espécies reactivas de oxigénio, o que sugere a implicação das mesmas em funções bioquímicas e hemoreológicas. O objectivo principal deste estudo foi avaliar e comparar os parâmetros hemoreológicos e bioquímicos dos eritrócitos de doentes de ELA com os de dadores saudáveis. Para além disso, o projecto pretendeu identificar um parâmetro que, uma vez aumentado ou diminuído na doença, por comparação à situação fisiológica normal, se pudesse destacar como biomarcador. Para tal, fez-se colheita de amostras sanguíneas de 40 controlos e de 82 doentes de ELA, depois de todos os participantes terem assinado o consentimento informado. Foram feitos testes que estimassem a agregação e deformabilidade eritrocitárias, o efluxo de NO, a actividade enzimática da AChE e as concentrações intraeritrocitárias de nitritos, nitratos e GSNO. Verificou-se que a deformabilidade e actividade da AChE estavam aumentadas nos doentes de ELA por comparação aos controlos. Por outro lado, o efluxo eritrocitário de NO e concentração intraeritrocitária de nitritos foram menores na doença. Não foram observadas diferenças significativas entre o grupo controlo e de doentes quanto à agregação e concentrações intraeritrocitárias de nitratos e GSNO. Porém, considerando exclusivamente os doentes de ELA, foi verificada uma relação entre a concentração de nitritos existente dentro dos eritrócitos e a actividade da AChE, na qual os nitritos, apesar de existirem sempre em baixas concentrações dentro dos glóbulos vermelhos dos doentes, estão aumentados em duas gamas de valores específicos de actividade da AChE. Uma vez que este aumento de nitritos é concordante com o efluxo de NO do eritrócito para os mesmos valores de actividade de AChE, pode ser sugerido um mecanismo compensatório no qual há menos libertação de NO quando os nitritos estão reduzidos no interior do glóbulo vermelho e mais efluxo de NO em valores de AChE para os quais os nitritos existem mais no interior do eritrócito. Foi igualmente demonstrada uma relação entre o efluxo de NO e a Função Respiratória dos participantes, na qual concentrações superiores de NO fora do eritrócito correspondem a uma pior função respiratória. Assim, é legítimo concluir que se o NO fosse mantido no interior do glóbulo vermelho, a Função Respiratória seria mais facilmente assegurada, ou seja, seria benéfico que o eritrócito actuasse como captador e reservatório de NO. Contudo, o estudo mostrou que o NO não é mantido no eritrócito, o que, mais uma vez e considerando o sistema pulmonar, pode ser justificado por um mecanismo compensatório no qual, quando a Função Respiratória está comprometida, o eritrócito liberta mais NO para que este possa ser utilizado pelos tecidos pulmonares. Os resultados do presente estudo indicam que o eritrócito pode contribuir para a biodisponibilidade do NO, apresentando uma deformabilidade favorável num endotélio disfuncional, como o descrito na ELA. Adicionalmente, os resultados sugerem que a AChE do eritrócito possa vir a ser um marcador na ELA. Para tal propõe-se a continuação deste estudo com a introdução de mediadores pró e anti-inflamatórios e a análise da associação com os valores da AChE.Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a progressive fatal neurodegenerative disease of the motor system. It is characterized by the death of the cortical, brainstem and spinal motor neurons. Most people develop ALS between the ages of 40 and 70 and the diagnosis relies on clinical observation and neurophysiological studies. Major symptoms are weakness, fatigue and progressive paralysis of all muscles. Between 90-95% of ALS cases are sporadic (sALS), without a genetic basis, and the remaining 5-10% cases are familial (fALS) and autosomal dominant inherited. Among these familial ALS mutations, about 20% occur in the gene for copper, zinc-superoxide dismutase (SOD1). When enzymatic activity of SOD1 is affected, the anion superoxide levels increase, generating cellular oxidative stress. In fact, the erythrocytes of patients with ALS present mutant SOD1 and dysregulation of the enzyme activity of glutathione peroxidase, glutathione reductase and glucose-6-phosphate dehydrogenase. At the moment three critical questions are still open: understanding the etiology of the disease, identification of molecular biomarkers and finding effective therapeutic agents. Red Blood Cells (RBCs) transport oxygen to the tissues and carbon dioxide from the tissues. Erythrocytes also contribute to the regulation of vascular tone both by affecting blood viscosity and by capturing and releasing of vasoactive agents, such as nitric oxide (NO). Nitric oxide (NO) is a signalling molecule produced in the central nervous system (CNS) that modulates neurological activity and blood flow. As a participant in oxidative stress, NO can mediate neuroprotection or neurotoxicity. As a neurotoxic factor, NO promotes oxidative stress through its reaction with superoxide anion to form peroxynitrite, and subsequently, other reactive derivatives. As a whole, these Reactive Nitric Oxide Species (RNOS), can induce DNA strand breaks, lipid peroxidation, protein nitration and nitrosylation, mitochondrial damage and cell apoptosis, contributing to neuroinflammation processes, thought to be involved in ALS. Once synthesized in endothelial cells by Endothelial Nitric Oxide Synthase (eNOS), NO can also diffuse to the adjacent smooth muscle cells or to the vascular lumen. When in the muscle, NO leads to muscle relaxation. When diffused to vascular lumen, NO is captured by RBCs that store and release this molecule, regulating erythrocyte aggregation and deformability and affecting their ability to transit across the capillaries. When scavenged by the erythrocyte, NO undergoes various reactions from which GSNO, nitrite and nitrate, relatively inert compounds, are produced. Acetylcholinesterase (AChE) is located on the outer surface of the erythrocyte membrane, where it is known as a marker of membrane integrity, maintaining normal blood rheology and tissue oxygenation. Non-neuronal acetylcholine (ACh) may be regarded as a modulator of erythrocyte hemorheological properties and as an essential cellular signalling molecule that contributes to the maintenance of cellular homeostasis, having a central role in the microvasculature. It exists in blood circulation and acts as an effector of vasodilation, since it stimulates the production of NO from eNOS, depending on the degree of endothelium integrity. ACh may also have an important role in the mobilization of NO and its derivatives in erythrocytes. In this mechanism, binding of circulating ACh with AChE in the erythrocyte membrane initiates a signal transduction mechanism that involves Gi and band 3 proteins, stimulating NO efflux and mobilization of nitrite and nitrate. As mentioned above, the RBCs of ALS patients present an excess of oxygen reactive species, which raises the hypothesis of their implication in erythrocyte biochemical and hemorheological functions. The main objective of this research was to evaluate and compare the biochemical and hemorheological parameters in RBCs of patients with ALS and of healthy donors. Therefore, this project was expected to identify a parameter that once increased or diminished in the disease may serve as a biomarker. To achieve these goals, venous blood samples from 40 healthy donors and 82 ALS patients were collected after formal consent. Tests considering erythrocyte aggregation and deformability, NO efflux, AChE enzymatic activity and intraerythrocytic concentration of nitrite, nitrate and GSNO were performed. Erythrocyte deformability and AChE activity were increased in patients with ALS in comparison to healthy donors. On the other hand, NO efflux and concentration of intraerythrocytic nitrite were lower in the disease. No significant differences were observed on the other parameters studied. However, considering ALS patients, there was a relation between the level of intraerythrocytic nitrite and AChE activity and between the efflux of NO and the Respiratory Function of patients. The results of the present study indicate that erythrocyte may contribute to control the NO bioavailability at microcirculatory level, presenting favourable deformability in the dysfunctional endothelium associated to the disease. Moreover, erythrocyte AChE should be further explored as a potential biomarker for ALS