The role of inflammation in the coupling of atherosclerosis and osteoporosis

Tese de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015A aterosclerose é uma doença crónica inflamatória que afecta as paredes dos vasos onde ocorre a formação de placas de ateroma. Estas placas de ateroma são o resultado da acumulação de lípidos, células inflamatórias, resíduos celulares e cálcio e, consequentemente há um aumento do risco para a ocorrência de eventos cardiovasculares. A aterosclerose inicia-se com a disfunção das células endoteliais e expressão de VCAM-1 (Vascular Cell-Adhesion Molecule 1) ao qual se ligam monócitos e células T que migram para o tecido arterial, aumentando a produção de citocinas, factores de crescimento, acumulação de lípidos, proliferação de células do músculo liso e aumento da secreção de moléculas de adesão. Estes eventos todos reunidos levam à formação de células espumosas pró-inflamatórias e culmina na formação das placas de aterosclerose. Os factores de risco para a ocorrência desta doença são vários, entre os quais destacam-se o aumento da idade, o sexo masculino, hábitos tabágicos, problemas de hipertensão, dislipidémia, outras doenças como a diabetes mellitus e também alterações genéticas próprias de cada indivíduo. O processo inflamatório está na base desta doença que é mediada por várias citocinas pró-inflamatórias, como a interleucina (IL-)1β, a IL-6, TNF (tumor necrosis factor) e a IL-17A, que vão desempenhar vários papéis no desenvolvimento da placa e também na deposição de cristais de cálcio na mesma. Todos estes factores levam a uma ossificação das placas, por processos ainda pouco esclarecidos e controversos: por um lado crê-se que esta ossificação possa ocorrer pela proliferação de células do tipo dos osteoblastos, por outro poderá ocorrer por um mecanismo semelhante à ossificação endocondral que ocorre na formação dos ossos, com expressão de um fenótipo semelhante ao dos condrócitos por parte das VSMCs (Vascular Smooth Muscle Cells). A Osteoporose (OP), importante causa de morbilidade e mortalidade, deriva da perturbação óssea esquelética. Revela-se na diminuição da resistência óssea, elevando assim o risco de fractura. Podemos encontrar dois tipos de osteoporose, a primária e a secundária. A primária é causada sobretudo pela perda de massa óssea derivada do aumento da idade e a secundária surge como consequência de outras patologias ou do uso de determinada medicação. A progressão e agravamento da doença dá-se não só derivado a fatores genéticos e hormonais, bem como a determinados estilos de vida ou doenças concomitantes. O osso é um tecido em constante remodelação ao longo da vida. Quando sofre danos, como no caso das fracturas, estes são reparados preservando a homeostase de cálcio e fósforo. O processo resulta da acção coordenada entre as células responsáveis pela reabsorção óssea, os osteoclastos e as células formadoras de osso, os osteoblastos, pelo que se torna essencial uma comunicação sincronizada entre os dois tipos de células. Para além da síntese e deposição proteica da matriz extracelular, os osteoblastos são também responsáveis pela síntese e secreção de moléculas que iniciam e controlam a diferenciação dos osteoclastos. A diferenciação de precursores de osteoclastos em osteoclastos multinucleados activados ocorre num processo denominado osteoclastogénese, que é regulado pelos osteoblastos e modulado por duas citocinas, o MCSF (Macrophage Colony Stimulating Factor) e o RANKL (Receptor Activator of NF-kB Ligand), membro da família TNF que se liga ao seu recetor RANK (Receptor Activator of NF-kB). Outra citocina importante neste sistema é a osteoprotegerina (OPG), uma glicoproteína solúvel que pertence à família do TNF. Para que ocorra um correcto desenvolvimento do osso, o sistema RANK/RANKL/OPG tem de estar em homeostase. Contudo, apesar de caraterísticas do metabolismo ósseo estas moléculas foram já identificadas nos processos de desenvolvimento da aterosclerose. A nossa hipótese é que existem mecanismos comuns adjacentes às duas doenças que levarão ao desenvolvimento simultâneo e frequente das duas patologias no mesmo indivíduo. No sentido de dar resposta às nossas questões foi realizada a avaliação da expressão génica, no osso e na aorta de dadores cadáver, de moléculas inflamatórias ou envolvidas no metabolismo ósseo no sentido de perceber a possível relação entre estes dois tecidos, usando uma população representativa da heterogeneidade da população. As mesmas proteínas foram também doseadas no soro dos mesmos indivíduos com o intuito de compreender a existência de uma relação entre o que se passa ao nível dos tecidos com o que ocorre de forma sistémica. Como segundo objetivo deste trabalho pretendemos compreender a relação dos marcadores de inflamação e do metabolismo ósseo em placas de aterosclerose de doentes com aterosclerose avançada que foram submetidos a endarterectomia carotídea e tentar entender a relação com a densidade mineral óssea e outros dados clínicos dos mesmos indivíduos. Para além disso, também nestes doentes foram doseadas proteínas séricas, por ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), no sentido de perceber os efeitos sistémicos no organismo. Os nossos resultados mostraram que existe alguma relação entre a expressão génica no osso e na aorta dos dadores cadáver para alguns marcadores do metabolismo ósseo, como o RANKL, a CTSK e o CBFA-1 e para os marcadores de inflamação IL-1β e IL-6. No entanto, estes resultados necessitam ser confirmados aumentando o número de amostras e deve ainda ser determinada a expressão génica destes mesmos marcadores noutro tecido, no sentido de confirmar se será específico destes dois tecidos ou se a mesma relação é encontrada também noutros tecidos independentes das patologias em estudo. Quanto aos doentes com aterosclerose, os níveis de cálcio sérico parecem estar relacionados com a presença de marcadores do metabolismo ósseo nas placas (RANKL, OPG e CBFA-1) e também com a citocina inflamatória IL-6. Também a relação entre níveis séricos de vitamina D e citocinas inflamatórias como a IL-6 e a IL-17A, e remodeladoras do osso, como o RANKL e P1NP sugerem o seu papel na regulação destes mediadores. Como era de esperar, a expressão de alguns dos marcadores de remodelação do osso revelou uma associação com a densidade mineral óssea e o T-score medido pelas densitometrias ósseas. Por fim, também os marcadores dos osteoblastos e osteoclastos apresentaram uma relação inversa com a idade, apoiado pelas mudanças que ocorrem nos percursores destas células com o avançar da idade. Apesar de estatisticamente não termos obtido resultados muito robustos, com coeficientes de correlação baixos, encontrámos algumas pistas sobre a relação entre as duas doenças. Primeiro, porque conseguimos determinar expressão génica de moléculas específicas do osso, tanto nos vasos de dadores cadáveres, como nas placas de aterosclerose dos doentes. Segundo, porque muitos destes factores mostraram relação com os níveis séricos de cálcio e vitamina D, conhecidos por terem um forte papel no osso e cuja desregulação pode levar a uma diminuição da densidade mineral óssea. Por último, a expressão de factores importantes na remodelação óssea (RANKL) e de marcadores de osteoblastos (CBFA-1 e COL-1) nas placas de aterosclerose, associados a alterações da densidade mineral óssea e ao aumento do risco de futuras fraturas, indicam que estes mecanismos poderão ser muito importantes na compreensão da relação entre as duas doenças, a aterosclerose e a osteoporose.Atherosclerosis is an inflammatory disease characterized by plaque formation, progressive diminishing of the calibre of arteries and increased risk of cardiovascular events. Osteoporosis (OP) is a bone disorder characterized by decreased bone mineral density and microarchitecture deterioration that leads to increased fracture risk. These two diseases are responsible for a high mortality and morbidity and usually coexist in the same individual. The existence of inflammatory mechanisms underlying both pathologies, evidenced by the presence of proinflammatory cytokines (such as IL-1, IL-6 or TNF) both locally and at systemic level, corroborates the hypothesis of a linkage between the two diseases. Additionally, dysregulation of RANK/RANKL/OPG system, fundamental in osteoclastogenesis, can contribute to the increased risk of cardiovascular disease and simultaneously of OP. With this project we intend to determine pathophysiological processes common to both diseases that co-substantiate their relationship. Thus, gene expression of pro-inflammatory and bone metabolism related proteins were analysed both in artery and bone samples from cadaver donors and posteriorly, the relation between gene expression and protein seric levels were explored in patients with evolved atherosclerosis. Our results showed a relationship between gene expression in bone and aorta for both bone remodelling markers (RANKL, CTSK and CBFA-1) and inflammation markers (IL-1β and IL-6) in samples from cadaver donors. Further studies are needed to evaluate a larger number of samples and also to understand if these relations are specific of this tissues or if is extended to other tissues. In samples from patients with atherosclerosis, we found serum calcium levels to be associated with the presence of bone metabolism markers in plaques (RANKL, OPG and CBFA-1) and IL-6. The relationship between serum vitamin D levels and IL-6, IL-17A, RANKL and P1NP highlights its possible role in the regulation of these cytokines. Also, there was a relation between the expression of bone remodelling markers in plaques and the bone mineral density (BMD) and femoral neck T-score and markers for osteogenic cells were influenced by age. With our work we unveil a possible relation between the expression in bone and aorta of markers of bone remodelling and inflammation. In a context of evolved atherosclerosis, frequently associated with low BMD and consequent osteoporosis (although not always diagnosed), calcium and vitamin D influence inflammation and bone remodelling markers in the plaques and these bone remodelling markers determined in plaques are also associated with alterations in BMD. Atherosclerosis is an inflammatory disease characterized by plaque formation, progressive diminishing of the calibre of arteries and increased risk of cardiovascular events. Osteoporosis (OP) is a bone disorder characterized by decreased bone mineral density and microarchitecture deterioration that leads to increased fracture risk. These two diseases are responsible for a high mortality and morbidity and usually coexist in the same individual. The existence of inflammatory mechanisms underlying both pathologies, evidenced by the presence of proinflammatory cytokines (such as IL-1, IL-6 or TNF) both locally and at systemic level, corroborates the hypothesis of a linkage between the two diseases. Additionally, dysregulation of RANK/RANKL/OPG system, fundamental in osteoclastogenesis, can contribute to the increased risk of cardiovascular disease and simultaneously of OP. With this project we intend to determine pathophysiological processes common to both diseases that co-substantiate their relationship. Thus, gene expression of pro-inflammatory and bone metabolism related proteins were analysed both in artery and bone samples from cadaver donors and posteriorly, the relation between gene expression and protein seric levels were explored in patients with evolved atherosclerosis. Our results showed a relationship between gene expression in bone and aorta for both bone remodelling markers (RANKL, CTSK and CBFA-1) and inflammation markers (IL-1β and IL-6) in samples from cadaver donors. Further studies are needed to evaluate a larger number of samples and also to understand if these relations are specific of this tissues or if is extended to other tissues. In samples from patients with atherosclerosis, we found serum calcium levels to be associated with the presence of bone metabolism markers in plaques (RANKL, OPG and CBFA-1) and IL-6. The relationship between serum vitamin D levels and IL-6, IL-17A, RANKL and P1NP highlights its possible role in the regulation of these cytokines. Also, there was a relation between the expression of bone remodelling markers in plaques and the bone mineral density (BMD) and femoral neck T-score and markers for osteogenic cells were influenced by age. With our work we unveil a possible relation between the expression in bone and aorta of markers of bone remodelling and inflammation. In a context of evolved atherosclerosis, frequently associated with low BMD and consequent osteoporosis (although not always diagnosed), calcium and vitamin D influence inflammation and bone remodelling markers in the plaques and these bone remodelling markers determined in plaques are also associated with alterations in BMD