Morphological and genetic variability analysis in the Rhipicephalus sanguineus (Parasitiformes, Ixodidae) portuguese populations

Tese de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015As carraças são artrópodes, da classe Arachnida, ectoparasitas obrigatórios e apresentam grande relevância médica e veterinária, devido à sua acção hematófaga e à sua capacidade de transmitir vários patogéneos, nomeadamente vírus, protozoários, helmintes e fungos. São consideradas o segundo vector mais importante na transmissão de agentes causadores de doenças humanas a seguir aos mosquitos, sendo responsáveis por mais de 100000 casos de doença humana em todo o mundo. De igual modo são, os vectores mais importantes em termos de transmissão de patógenios causadores de doença a animais domésticos e silvestres, e consequentemente responsáveis por grandes danos económicos. Dentro das várias espécies de ixodídeos existentes, o género Rhipicephalus da família Ixodidae é o que tem maior distribuição mundial, sendo simultaneamente um dos mais controversos, pela grande semelhança interespecífica evidenciada pelas espécies que agrupa. As espécies envolvidas, caracterizam-se ainda pela capacidade de parasitar uma grande diversidade de hospedeiros vertebrados e pela sua eficácia como vectores de diversos agentes patogénicos. Uma das questões dentro deste género está relacionada com a distinção de duas espécies nomeadamente R. sanguineus e R. turanicus que, devido a ausência de características morfológicas, permitam a sua distinção óbvia. Em particular, as carraças da espécie R. sanguineus constituem um risco para a saúde pública, uma vez que são responsáveis pela transmissão de uma grande diversidade de agentes patogénicos causadores de doenças a cães e humanos. As doenças mais graves em cães são a babesiose, causadas por Babesia canis e a erliquiose monocítica, causada por Erlichia canis. No que diz respeito aos humanos a doença mais grave é a febre botonosa ou escaro-nodular, transmitida pela bactéria Rickettsia conorri. Esta ultima é uma doença de declaração obrigatória em Portugal, apresentando uma taxa de incidência de 9,8/105 habitantes, uma das mais elevadas da Europa. Esta incidência deve-se ao facto de Portugal exibir condições ecológicas como vegetação adequada, grande variedade de hospedeiros e condições climáticas que propiciam a adaptação de carraças e dos agentes patogénicos por elas transmitidas. Acredita-se ainda que as alterações climáticas, que se têm verificado e que se irão intensificar nas próximas décadas, deverão contribuir para o agravamento desta situação, pois o aumento da temperatura média favorece a proliferação destes vectores. Portugal não é indiferente às questões taxonómicas existentes no género Rhipicephalus, em particular à distinção das espécies R. sanguineus e R. turanicus. Estudos conduzidos anteriormente indicavam a existência destas 2 espécies em Portugal mencionando que R. sanguineus se encontrava associado ao cão e que R. turanicus se encontrava associado a ruminantes. No entanto, estudos posteriores relevaram que estas duas espécies são morfologicamente idênticas e não distinguíveis do ponto de vista genético, em Portugal. Uma vez que estas duas espécies poderão estar associadas a capacidades patogénicas e vectoriais distintas e considerando, que Portugal possui características eco-ambientais que favorecem a manutenção e a proliferação de carraças e dos agentes patogénicos por elas transmitidas, é relevante em termos de saúde pública, a compreensão desta questão e conseguir caracterizar as populações portuguesas de R. sanguineus sensu lato. Sendo as espécies do género Rhipicephalus extremamente difíceis de identificar morfologicamente, devido à elevada variabilidade intraespecífica, os estudos morfológicos devem ser acompanhados de estudos moleculares, de modo a promover reconstruções taxonómicas mais consistentes e é neste contexto que este estudo surge. Assim, foi o principal objectivo desta dissertação avaliar e caracterizar morfologicamente através do estudo estatístico de variáveis quantitativas e qualitativas, o que levaram à formação de clusters qualitativos, quantitativos e morfológicos A partir destes clusters foi possível avaliar as diferenças que os caracterizavam e quais as variáveis que mais contribuíam para a sua distinção. Outro objectivo foi inferir se a variabilidade morfológica correspondia também a variabilidade genética. Para esse objetivo, vários espécimes representantes dos clusters formados foram selecionados para um estudo genético recorrendo os marcadores moleculares (12S e 16S). Os resultados obtidos revelaram a presença de uma grande variabilidade morfológica, formando 8 clusters morfológicos nos machos, e 5 nas fêmeas, os quais apresentam várias diferenças entre si, especialmente em termos das placas espiraculares nos machos e da abertura genital nas fêmeas. Os resultados obtidos neste estudo vieram ainda confirmar que as placas espiraculares nos machos e a abertura genital nas fêmeas são, de facto, as estruturas mais adequadas para diferenciar R. sanguineus de R. turanicus. Uma vez que se verifica que os machos R. turanicus possuem espiráculos mais largos e curtos e os machos de R. sanguineus, apresentam espiráculos mais finos e longos; as fêmeas de R. sanguineus apresentam aberturas genitais em forma de U aberto, com os escleritos bem afastados entre si, as fêmeas de R. turanicus apresentam abertura genital em forma de U fechado com os escleritos próximos um do outro, como havia sido previamente descrito na literatura. Os resultados moleculares revelaram a existência de variabilidade intraespecífica mas não suficientemente elevada para justificar a classificação em 2 espécies distintas. Foi ainda possível concluir que todos os haplotipos obtidos neste estudo se encontram inseridos no grupo R. sanguineus T2, e são genética e filogeneticamente distintos dos outros 3 grupos filogénicos previamente descritos (R. sanguineus T1, R. sanguineus sensu lato and R. turanicus). Os resultados suportam ainda a hipótese apresentada em estudos anteriores, que existem diferenças genéticas consideráveis entre a linhagem norte associada a clima tropical, e a linhagem sul associada a clima mais moderado. É ainda digno de destaque que alguns haplotipos obtidos com o marcador 16S, quando analisados filogenicamente surgem agrupados num ramo isolado, formando um de mini-clade, sugerindo que está a ser observado é muito provavelmente o início de um processo de especiação. No entanto, estes estudos deverão prosseguir no sentido da maior clarificação desta problemática.Ticks are arthropods with medical and veterinary importance. In particular R. sanguineus constitutes a risk to public health, being responsible for the transmission of several pathogens, namely Ricketsia conorii, the etiologic agent of Mediterranean spotted fever. This tick is very frequent in Portugal that currently presents one of the highest rates of incidence of tick borne diseases in Europe. Ticks belonging to genus Rhipicephalus are extremely difficult to identify morphologically, due to the high level intraspecific variability. Ticks from the R. sanguineus group are associated with controversy, once the species identification and distinction are sometimes difficult due to their morphological similarities specialy between R. sanguineus and R. turanicus, which is a particularly challenging task. Portugal is not indifferent to the taxonomic issues between this two species, since the results obtained in previous studies differ, and there is much disagreement around their taxonomic classification. In order to promote more consistent taxonomic reconstructions, morphological studies should be applied together with biological and molecular approaches. It is in this context that this study appears, once it combined a morphological study, in which several quantitative and qualitative variables were considered and studied through a-statistic analysis and simultaneously a rigorous morphological analysis was conducted on several specimens of Portuguese Rhipicephalus sanguineus. A representative sample from each clusters obtained were selected for a genetic study using 12S and 16S molecular marker. Results revealed the presence of great morphological variability in the Portuguese populations of R. sanguineus and also the existence of some interesting genetic variability. Although not enough to justify the classification as different species. However phylogenetic analysis highlight the grouping in separate tree branches, suggesting the possibility of the beginning of a speciation