Role of cysteine-rich proteins in the assembly of the spore surface layers in the intestinal pathogen Chlostridium difficile

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015Clostridium difficile is currently the main cause of intestinal nosocomial disease associated with antibiotic therapy in adults, and a growing concern in the community. C. difficile is a gram-positive, obligate anaerobe and endospore-forming bacterium. The spores are the main vehicle for transmission and persistence of the organism, and have been associated with disease recurrence. Ingested spores germinate in the anaerobic colon to establish a population that will produce more spores and the two main C. difficile virulence factors, the TcdA and TcdB cytotoxins. The surface layers contribute to the overall resistance of spores, and in addition are thought to play an important role during in the adherence of spores to the colonic mucosa during the initial stages of infection. However, the functional architecture and composition of the spore surface layers remains poorly characterized. The most abundant protein of C. difficile spores is Sp17. Sp17 is a 17 kDa cysteine-rich protein essential for the morphogenesis of the spore surface layers and of a spore polar appendage. sp17 is expressed at very high levels in vivo during infection of axenic mouse and is required for colonization. The spore polar appendage was proposed to mediate an interaction with a putative receptor located on the colonic mucosa. Interestingly, this appendage is found only in 24% of spores formed by a wild type strain. The bifurcation of the population in two spore morphotypes suggest diferent roles in the host, possibly in persistence and transmission of the organism. Here, we aimed at dissecting the role of Sp17 in spore assembly. First, we used a fluorescent reporter to show that sp17 is expressed later than other σK -target genes, such as the cotE gene. We then replaced the sp17 promoter by the stronger and earlier-activated PcotE and found that the level and timing of sp17 expression influences both the fraction of spores with appendage as well as the lenght of this structure. Hence, Sp17 is directly involved in assembly of the spore polar appendage. We demonstrated that spores with an appendage contain more Sp17 and in a multimeric form. Immunofluorescence revealed that Sp17 accumulates in arcs or patches along spores that lack a visible appendage, and at the spore pole on the edge of the appendage, when this struture is formed. Sp17 appears to have a dynamic behavior at the spore surface, nucleating assembly of the appendage when it accumulates at the spore poles. We also examined the role of another cysteine-rich protein, CdeC, in the assembly of the spore polar appendage. While CdeC seems to be required for assembly of Sp17, expression of sp17 is not a requirement for assembly of CdeC. Moreover, overexpression of cdeC alone has no effect on the frequence of appendage formation, and coexpression with sp17 does not enhances the effect of Sp17. Our data suggests that CdeC has a more internal localization than Sp17 in spores, lending support to a model in which CdeC forms a basal layer upon which Sp17 is assembled.Clostridium difficile é atualmente considerado a principal causa de doenças nosocomiais intestinais em adultos, associadas à toma de antibióticos, bem como uma preocupação crescente na comunidade. Indivíduos que apresentem o microbiota intestinal equilibrado são normalmente resistentes à infeção por C. difficile, uma vez que as bactérias comensais do intestino têm a capacidade de direta ou indiretamente prevenir a colonização por este patogéneo. C. difficile é capaz de causar infeção e doença, com sintomas variáveis que podem ir desde diarreia até colite pseudomembranosa, megacólon tóxico, sépsis e morte. Surtos de maior severidade da doença, maiores taxas de incidência, morbilidade e mortalidade têm sido acompanhados pela rápida emergência e dispersão de estirpes epidémicas, especialmente, mas não exclusivamente pertencentes ao ribotipo 027. Nos Estados Unidos da América a taxa de mortalidade para doenças associadas a C. difficile aumentou de 5.7 por milhão de habitantes em 1999, para 23.7 em 2004, sendo atualmente a infeção causada por este patogéneo, responsável por aproximadamente 3 milhões de casos de diarreia e colite anualmente. O tratamento de infeções causadas por C. difficile tem custos médicos anuais associados, estimados em 1.1 biliões de dólares nos EUA e em 3 biliões na Europa. Em Portugal, a primeira detecção de estirpes epidémicas “hipervirulentas” pertencentes ao ribotipo 027, associadas a um surto hospitalar, data de Janeiro de 2012 envolvendo 12 pacientes, com uma taxa de mortalidade de 50%. Mutações que conferem resistência a antibióticos, que aumentam a produção de toxinas ou que facilitam a esporulação têm aumentado a prevalência e a incidência deste patogéneo oportunista. C. difficile é uma bactéria Gram-positiva, anaeróbia obrigatória e formadora de esporos. Os esporos são extremamente difíceis de erradicar, podendo acumular-se no meio ambiente ou no hospedeiro por longos períodos de tempo. São considerados como o principal veículo de transmissão e persistência do microrganismo sendo cruciais para a sobrevivência deste anaeróbio estrito fora do cólon. Têm sido apontados ainda como cruciais na recorrência da doença. Os esporos, uma vez ingeridos, têm a capacidade para ultrapassar a barreira gástrica do estômago, chegando ao intestino onde aderem às células epiteliais. Ao germinarem no colon anaeróbio estabelecem uma população que por sua vez produz mais esporos, bem como os dois principais factores de virulência desta bactéria, as citotoxinas TcdA e TcdB. Estas são translocadas para o citoplasma das células alvo e inativam, por glicosilação, proteínas reguladoras da formação do citoesqueleto eucariota, e levam à desorganização do mesmo, seguindo-se de morte celular. Os danos causados pelas toxinas na mucosa do cólon poderão eventualmente conduzir a diarreia que permite a libertação dos esporos e a sua transmissão para um novo hospedeiro. As camadas superficiais do esporo conferem resistência a condições ambientais extremas e especula-se que desempenhem um papel importante na adesão dos mesmos à mucosa do cólon numa fase inicial de infeção. Apesar da importância dos esporos na patogénese de C. difficile, a arquitetura funcional e a composição das camadas da superfície do esporo estão ainda pouco caracterizadas. Sp17 é a proteína mais abundante da superfície do esporo de C. difficile. Com 17 kDa e rica em cisteínas, é essencial à morfogénese das camadas superficiais do esporo, e de um apêndice localizado no polo do esporo. Os esporos de um mutante sp17 não são capazes de montar a estrutura polar que é observada nos esporos selvagens. O gene sp17 é expresso, sob o controlo de σK, em níveis elevados in vivo durante a infeção de ratinhos axénicos e é necessário para a colonização. Pensa-se que o apêndice polar do esporo possa mediar a interação com um possível receptor localizado na mucosa do cólon. Curiosamente, este apêndice é encontrado apenas em 24% dos esporos da estirpe selvagem. Uma bifurcação em dois morfotipos de esporos sugere funções diferentes no hospedeiro, nomeadamente na persistência e na transmissão do organismo. Possivelmente, a fração de esporos que apresenta esta estrutura poderá aderir mais eficientemente e assegurar a persistência do organismo no hospedeiro, enquanto que a restante população pode imediatamente germinar, produzir toxinas e esporular. Neste estudo, procurou-se dissecar o papel da proteína Sp17 na formação do esporo. Em primeiro lugar, foi utilizado um gene repórter fluorescente (SNAP) para mostrar que o gene sp17 é expresso mais tarde do que outros genes σK -dependentes, tal como o cotE e o cdeC. Em seguida, o promotor do sp17 foi substituído pelo promotor do gene cotE, mais forte e ativado mais cedo, e descobriu-se que o nível e tempo de expressão do sp17 influenciam a fração de esporos com apêndice, bem como o comprimento desta estrutura. Desta forma foi demonstrado que Sp17 está diretamente envolvida na montagem do apêndice do esporo. Através de um gradiente descontínuo de Gastrografina foi possível separar esporos com e sem apêndice, seguindo-se a análise dos extractos proteicos dos esporos por immunobloting, usando o anticorpo contra a proteína Sp17. Demonstrou-se que os esporos com apêndice contêm mais Sp17 e em formas multiméricas. A ligação entre a expressão do gene sp17 e a formação de esporos com apêndice levou-nos a investigar a localização da Sp17 em esporos maduros. A imunofluorescência revelou que a Sp17 acumula-se em arcos ao longo dos esporos que não possuem um apêndice visível, e sobre a extremidade do apêndice, quando esta estrutura é formada. A Sp17 parece ter um comportamento dinâmico na superfície do esporo, podendo nuclear a montagem do apêndice, quando acumulada no pólo do esporo. Uma importante característica das proteínas envolvidas na formação de apêndice de C. taenosporium é o elevado conteúdo de cisteínas, sugerindo que os componentes do apêndice podem estar covalentemente ligados por ligações dissulfureto. Foi também estudado o papel de uma outra proteína presente na superfície do esporo de C. difficile, rica em cisteínas, CdeC, na montagem do apêndice. Enquanto a proteína CdeC parece ser necessária para a correta localização da Sp17, a expressão do gene sp17 não é um requisito para a montagem da CdeC no esporo. Além disso, a sobre-expressão do gene cdeC não tem nenhum efeito sobre a fração de esporos com apêndice, e a co-expressão com o sp17 não aumenta o efeito da Sp17, sugerindo que a proteina CdeC não está directamente envolvida na montagem do apêndice. Os nossos dados sugerem ainda que a proteína CdeC está localizada no esporo mais internamente do que a Sp17, apoiando o modelo em que a CdeC forma uma camada basal sobre a qual é montada a Sp17 e possivelmente outras proteínas da superfície do esporo. O trabalho aqui desenvolvido revela a importância e o papel de duas proteínas ricas em cisteínas, Sp17 e CdeC, na morfogénese das camadas superficiais do esporo, e na montagem de um apêndice polar do esporo, no caso da Sp17. O facto de serem proteínas exclusivas de C. difficile sugere que a superfície do esporo deste organismo tem propriedades funcionais e estruturais distintas que provavelmente representam adaptações à colonização dos seus hospedeiros. Dada a importância dos esporos na disseminação deste organismo, a detecção de componentes abundantes do esporo que são únicos de C. difficile constituem uma boa alternativa para a maioria dos métodos de diagnóstico atualmente disponíveis. Dada a ausência de vacinas adequadas, medidas de controlo de infeção são necessárias para controlar a dispersão da infeção causada por este organismo. A proteína Sp17 poderá ser uma forte candidata para uma vacina contra esta bactéria anaeróbia