Tipagem molecular de estirpes de Brucella spp.

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015A brucelose é uma das zoonoses bacterianas mais comuns a nível mundial, podendo infetar o Homem e animais, constituindo por isso um importante problema de saúde pública. Em Portugal, a brucelose é uma doença endémica e encontra-se entre as 3 zoonoses com maior incidência no país. É causada por bactérias Gram-negativas do género Brucella. As bactérias deste género são muito próximas geneticamente, apresentando uma homologia superior a 90%, o que dificulta a sua identificação e genotipagem. Sendo uma bactéria intracelular, a patogenicidade de Brucella baseia-se na sua capacidade de penetrar, sobreviver e de se multiplicar no interior das células do hospedeiro. Um dos elementos envolvidos na virulência de Brucella são as proteínas efetoras, secretadas para o interior das células do hospedeiro, através de um sistema de secreção (T4SS). O objetivo deste trabalho foi a caracterização e o estudo da variabilidade genética de 3 genes efetores (BAB1_0296, BAB1_1101 e BAB1_1533), e a genotipagem molecular de estirpes de Brucella, pertencentes à coleção do INSA, utilizando metodologias moleculares, tais como o PCR (Polymerase Chain Reaction), a sequenciação de DNA e MLVA (Multiple-Locus Variable number tandem repeats Analysis), bem como métodos bioinformáticos para análise de sequências e inferência filogenética. No estudo dos efetores verificou-se uma grande homologia entre as sequências, evidenciando a elevada conservação destes genes possivelmente associados à virulência. O ensaio MLVA16 revelou-se altamente discriminatório, com os loci do painel 2B a apresentar valores de Índice de Diversidade mais elevados (>0,7). Nos estudos de filogenia realizados é de salientar que as estirpes de B. abortus e B. melitensis se mostraram próximas entre si e as estirpes pertencentes a B. suis mais divergentes e próximas entre si. A caracterização molecular de Brucella e o desenvolvimento de métodos de tipagem, cada vez mais robustos, é de grande importância em diversas áreas, como diagnóstico, estudos de diversidade genética, em contexto evolutivo ou vigilância epidemiológica, caracterização de surtos e investigação de mecanismos de virulência.Brucellosis is a worldwide zoonotic disease that can infect both humans and animals and therefore is a major public health concern. In Portugal, brucellosis is an endemic disease and it is among the three zoonoses with the highest incidence in the country. It is caused by Gram negative bacteria of the genus Brucella. The bacteria of this genus are very close genetically, with a degree of homology higher than 90%, which causes their identification and genotyping to be challenging. Being an intracellular bacterium, Brucella pathogenicity is based on its ability to penetrate, survive and multiply within the host cell. Effector proteins are one of the many factors involved in the virulence of Brucella and they are secreted within the host cells, through a Type 4 Secretion System (T4SS). The aim of this work was to assess the genetic variability of three effector genes (BAB1_0296, BAB1_1101 and BAB1_1533) and genotyping of Brucella strains from INSA’s repository, using molecular methods, such as PCR (Polymerase Chain Reaction), DNA sequencing, MLVA (Multiple-Locus Variable number tandem repeats Analysis), and bioinformatics tools for sequence analysis and phylogenetic studies. The effector’s study showed a high degree of homology between the sequences, suggesting the high conservation of these potential virulence genes. The MLVA16 assay proved to be highly discriminatory, with the loci of panel 2B showing the higher Diversity Index values (>0.7). The phylogenetic reconstruction revealed the close relationship between B. abortus and B. melitensis and grouped B. suis as the most divergent species. Molecular characterization of Brucella and the development of more robust typing methods is of great importance in areas such as diagnosis, genetic diversity studies, in both evolutionary and epidemiological surveillance contexts, outbreaks characterization and virulence mechanisms investigation