A 31P MR spectroscopy study on rat models of liver disease

Tese de mestrado integrado em Engenharia Biomédica e Biofísica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2014O objectivo deste projecto assenta no desenvolvimento e optimização de técnicas de Espectroscopia por Ressonância Magnética com Fósfoto-31 (31P MRS), para a avaliação do conteúdo metabólico e descoberta de biomarcadores em modelos de patologia hepática. A Espectroscopia por Ressonância Magnética é uma técnica não invasiva utilizada para estudos metabólicos, qualitativos e quantitativos. Esta técnica permite, especificamente no caso do Fósforo-31, a avaliação e quantificação de metabolitos cuja composição contenha Fósforo, como é caso da Fosfocreatina, Adenosinatrifosfato ou o Fosfato Monosódico. Através da avaliação qualitativa e quantitativa destes metabolitos há como objectivo a asserção de diversas patologias e alterações metabólicas de forma consistente, segura e não invasiva. O estudo tem como base a optimização de sequências pré-existentes, como ISIS (Image Selected In-Vivo Spectroscopy), CSI (Chemical Shift Imaging) e SPULS (Single Pulse and 1D acquire), assim como o desenvolvimento de uma sequência de localização 1D sem auxílio de gradientes. Esta sequência, denominada SATSP (SATurated Single Pulse), tem como base a sequência SPULS, que consiste na utilização de um único pulso de excitação (hard pulse) para a obtenção de informação espectroscópica, acrescentando-lhe um pulso de saturação prévio (neste caso específico baseado na sequência PRESS). O objectivo é proceder à saturação de toda a área não desejada antes da excitação do tecido e aquisição do sinal. O pulso de excitação é então aplicado uniformemente, sendo possível obter sinal apenas da região não saturada. Assim, todo o sinal adquirido terá como origem a área de interesse que, em última instância, deverá corresponder ao fígado. O projecto inclui o design e posterior utilização de uma fantoma (denominado Liver Phantom) de dois compartimentos cujo objectivo é simular um corte transversal da região abdominal de um rato Sprague Dawley, contendo uma primeira camada simulando pele/músculo/gordura (1º compartimento, com um volume de 10ml situado em contacto com a surface coil, contendo Fosfato Dissódico, 40mM), e uma segunda camada simulando o fígado (2º compartimento, com um volume de 35 ml, situado do lado oposto à surface coil, contendo Ácido Fenil Fosfórico, 10mM). A escolha dos componentes teve como base a sua fácil distinção a nível de frequência de ressonância (apresentam-se bastante distantes no espectro), e o facto de ambas as substâncias gerarem apenas um pico visível no espectro. Foram também adquiridos dados experimentais in-vivo (ratos Sprague-Dawley, grupo de controlo n=2, grupo de modelo de doença n=2), os quais foram posteriormente comparados com artigos de referência. Aos ratos pertencentes ao grupo de modelo de doença, administrou-se, por via intraperitoneal, Tetracloreto de Carbono (CC14) durante um período de 8 semanas, duas vezes por semana, causando fibrose hepática avançada ou início de cirrose. Para ambas as situações, in vitro e in vivo, foram descritos protocolos experimentais específicos que detalham a ordem dos acontecimentos, os métodos de calibração e possibilidades de shimming (manual e automático). Todos os dados experimentais foram adquiridos especificamente para este projecto, utilizando um scanner pré-clínico de pequeno diâmetro Varian 7T, Surface Coil Tx/Rx Doty30 (1H/31P) e software de aquisição vNMRj 3.2, sendo os resultados processados com o auxílio do software jMRUI e Matlab. Todo o harware utilizado foi cuidadosamente descrito, começando pelo scanner e os seus vários componentes, até ao material utilizado na preparação da aquisição e durante a mesma. Foram especificadas as diferenças de material utilizado in vitro e in vivo, de modo a estabelecer um contraste de complexidade entre as duas modalidades. Relativamente à análise dos resultados, o método de processamento de dados utilizado foi o AMARES (Advanced Method for Accurate, Robust and Efficient Spectral fitting), que tem em conta parâmetros pré-estabelecidos pelo utilizador. Uma descrição detalhada do método de análise encontra-se disponível nesta dissertação, desde a preparação dos dados, ao nível da correcção de fase, zero filling ou truncagem, até à escolha de parâmetros a utilizar com o algoritmo AMARES. No contexto de análise espectroscópica in vivo ao fígado, e no caso da espectroscopia com Fósforo-31, foram 6 os metabolitos tidos em conta, nomeadamente Fosfomonoesteres (PME), Fosfodiesteres (PDE), Fosfato Inorgânico (Pi), Adenosina Trifosfato (ATP-α, β e γ), Fosfocreatina (PCr) e Dinucleótido de Nicotinamida e Adenina (NADH). Variações na concentração e rácios de PDE, PME, Pi e ATP foram previamente referenciadas como possíveis indicadores de alterações patológicas na actividade hepática e, como tal, foram atentamente estudadas. Os resultados indicaram uma variação no rácio PME/(PME+PDE), denominado Anabolic Charge, entre os dois grupos em estudo. Especificamente, o grupo de controlo apresenta valores de AC mais baixos do que o grupo de modelo de doença. Existe também um aparente decréscimo de concentração absoluta de PDE no grupo de modelo de doença, embora a falta de dados comparativos impossibilite uma maior certeza neste parâmetro. Não foram detectadas variações consideradas significativas no rácio de ATP e Pi. Foi sugerido o aumento da amostra de ambos os grupos (controlo e modelo de doença) de modo a obter resultados que expressem de uma forma mais segura e significativa as diferenças entre os dois grupos, assim como um estudo longitudinal que incluísse a recolha histológica de dados em simultâneo com o estudo espectroscópico. A utilização de uma Volume Coil em combinação com a Surface Coil utilizada foi considerada como uma das possíveis mais valias a acrescentar no futuro. Paralelo ao estudo metabólico previamente descrito foi criado um mapa de Flip Angle para a Surface Coil Doty30, utilizada durante o estudo, o qual evidenciou problemas de alcance e baixa homogeneidade de campo, assim como um estudo inicial de qualtificação metabólica absoluta. O mapa de Flip Angles da Surface Coil Doty30 foi criado através do método do rácio do ângulo duplo. Para este método são adquiridas duas imagens Gradient Echo, a primeira com um flip angle arbitrário x, e outra com um flip angle 2x. . Através do rácio entre a magnitude de ambas as imagens adquiridas é possível chegar ao flip angle efectivo aplicado na amostra/tecido/etc. Para estas aquisições foi utilizado um pequeno fântoma de plástico com cerca de 50 ml de fosfato monosódico, com concentração 1M. Para a produção do mapa de Flip Angles foi desenvolvido de raiz um código Matlab que gera automaticamente os mapas, tendo como input as imagens de Gradient Echo adquiridas com flip angle x e 2x. O estudo mostrou um curto alcance na aquisição de sinal por parte da surface coil, cerca de 2cm de profundidade, e uma fraca homogeneidade de campo, algo esperado com uma coil deste tipo. Para estudos futuros foi sugerida a utilização combinada de uma volume coil para aplicação dos pulsos RF (maior homogeneidade de campo), e uma surface coil para a aquisição do sinal (maior proximidade). Para o estudo de quantificação metabólica absoluta, foi utilizado um método que envolve a troca do espécime após a aquisição in vivo, e a posterior replicação das condições iniciais para nova aquisição, desta vez utilizando um fântoma com uma concentração fosfórica conhecida. Foi utilizado um fântoma cilíndrico de vidro, com Ácido Fenil Fosfórico, 50mM. Este método foi apenas aplicado a um dos ratos do grupo de modelo de doença, servindo assim como prova de conceito para quantificação absoluta, não tendo havido comparação entre os dois grupos. Os resultados mostraram-se promissores, sendo um dos objectivos futuros a aplicação deste método em todos os estudos em que a quantificação absoluta possa ser benéfica. Como desvantagem, o método descrito implica a repetição das sequências utilizadas in vivo, elevando para o dobro o tempo de aquisição. Conclui-se que a Espectroscopia por Ressonância Magnética se apresenta como uma técnica viável a nível de quantificação metabólica não invasiva.The overall aim of the project is to evaluate the role of 31P Magnetic Resonance Spectroscopy in preclinical models of liver fibrosis and cirrhosis and to determine the utility of 31P MRS as non-invasive teste for biomarkers. Specifically, two main problems are to be addressed: the possibility of MRS providing reliable information on liver functional status in preclinical models, to the point of rendering multiple time point sampling (biopsy) obsolete; and identifying novel biomarkers that distinguish control and disease model groups. This study includes both In Vitro (with a specific designed liver phantom) and In Vivo data (Sprague-Dawley rats, control group n=2, disease model group n=2). Several pulse sequences were tested, with more relevance given to CSI (Chemical Shift Imaging) and SATSP (Satured Single Pulse, a newly made combination of a single pukse acquisition with prior use of saturation pulses) sequences. Results show some degree of variation in metabolite ratio between control and disease model groups, specifically with PME and PDE ratios. A bigger sample size for both control and disease model groups is proposed to further verify these claims