Targeting mutant KRAS in human colon cancer cells through G-quadruplex ligands

Teses de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2014KRAS mutations occur in 35 to 45% of colon tumors, being an important target for cancer treatment, for which there are no targeted therapeutics available. The objectives of this thesis were to downregulate transcription of mutant KRAS using DNA G-quadruplex ligands, and to evaluate their impact on proliferation and death of colon cancer (CC) cells. Ligands evaluated included ten indoloquinolines derivative compounds, seven iQc (3e, 3g, 3h, 3m, 13a, 14a, 3c) and three iQb (2a, 1a and 2d). These test compounds were synthesized and evaluated for preferential selectivity to the G-quadruplex region in human KRAS oncogene promoter (KRas21R), compared to a double-stranded hairpin loop sequence (T-Loop), by fluorescence resonance energy transfer (FRET) melting experiments. Effects on cell viability and death were evaluated using mutant KRAS CC cell lines (HCT116 and SW620) and non-malignant cells with wild-type KRAS (HEK293T and CCD18co). For most test compounds, we obtained IC50 and IC65 lower than those for 5-Fluorouracil (5-FU). Interestingly, in CC cell lines, particularly in HCT116, test compounds increased cell death, mainly by apoptosis, up to ~ 60% when compared to vehicle control, accompanied by increased p53 protein steady-state levels. Finally, to evaluate the effect of test compounds on KRAS repression, we evaluated KRAS protein and mRNA steady-state levels, obtaining a significant reduction of both KRAS protein and mRNA. Importantly, we next used a Dual-Luciferase Reporter Assay specific for KRAS promoter, to validate repression of KRAS promoter by the DNA G-quadruplex ligand test compounds. Our results showed that all test compounds interact with the KRAS promoter, inducing significant promoter repression. Collectively, our results suggest a higher dependence on KRAS signaling by tumor cells, particularly in HCT116, suggesting that inhibition of KRAS by these ligands could provide a promising novel therapeutic approach for the treatment of tumors with mutant KRAS, warranting additional investigation.O cancro coloretal (CCR) é o terceiro tipo de cancro com maior incidência e o quarto com maior mortalidade a nível mundial. Dados de 2014 reportam a incidência de 746.000 casos de CCR em homens e 614.000 casos em mulheres, estimando-se que esses números aumentem, respectivamente, para 1,36 e 1,08 milhões de casos, em 2035. O desenvolvimento de CCR encontra-se intimamente associado à progressão da idade, a fatores ambientais e ao estilo de vida. Cerca de 75% de novos casos deste tipo de cancro são de origem esporádica, enquanto os restantes 25% têm uma história familiar de CCR, o que sugere uma contribuição hereditária. Foram já identificadas mutações génicas como causa de risco acrescido de CCR hereditário, estimando-se que estas sejam responsáveis por apenas 5 a 6% dos casos de CCR. O desenvolvimento de CCR é um processo faseado, através do qual células normais do epitélio do cólon sofrem uma transformação, adquirindo capacidade proliferativa anormal e resistência aos mecanismos de apoptose, dando origem a adenomas. Estes adenomas podem evoluir para adenocarcinomas, cuja progressão pode conferir às células tumorais a capacidade de invadir tecidos adjacentes e de metastizar para órgãos distantes. Subjacente a este processo de patogénese do CCR, diferentes eventos moleculares, incluindo mutações somáticas e alterações epigenéticas, levam ao desenvolvimento e progressão do cancro, desregulando, entre outros, a expressão de oncogenes, genes supressores de tumores e microRNAs. O desenvolvimento de CCR está associado a uma sequência de acontecimentos moleculares complexa, na qual a transformação de epitélio normal para adenoma de pequena dimensão envolve, geralmente, mutações no gene APC, a passagem de adenoma de pequena dimensão para adenoma de grande dimensão envolve mutações no gene KRAS, e por último, o estabelecimento do cancro está associado a mutações no gene p53, entre outras. Em particular, as mutações no gene KRAS apresentam uma incidência de cerca de 30% no cancro, em geral e de 40-50% em cancro do cólon. Este gene codifica para uma GTPase que se encontra ancorada ao folheto interno da membrana celular através da sua cadeia C-terminal, funcionando como um intermediário molecular de sinalização celular. Tem como principal função a integração de sinais extracelulares para sinais intracelulares, via recetor de membrana EGFR, através de diferentes vias de sinalização como por exemplo, cinases do tipo RAF, fosfoinositído 3-cinase (PI3Ks), fosfolipase Cε (PLCε) e proteínas RalGDS. A sinalização através destas vias tem como resultado final a génese de estímulos de sobrevivência, proliferação e crescimento celular. A presença de mutações somáticas nas posições 12, 13, 61 e 63 da região codificante do gene KRAS são responsáveis pela ativação constitutiva desta GTPase, reduzindo a sua capacidade de hidrólise de GTP (forma ativa) para GDP (forma inativa) e levando a uma produção constitutiva de estímulos intracelulares que promovem a proliferação e sobrevivência celular, de forma independente da regulação pelo EGFR. Ao longo dos últimos anos, foi registado um importante progresso na eficácia de deteção e tratamento do cancro do cólon, em particular com a introdução de novas terapias dirigidas, das quais se destaca a terapia com anticorpos monoclonais de bloqueio do recetor de membrana EGFR através do uso de Cetuximab e Panitumumab. Estes agentes terapêuticos são utilizados no tratamento complementar a procedimentos de remoção cirúrgica, radioterapia ou quimioterapia de doentes em estadio avançado do CCR que, frequentemente, resistem à terapêutica convencional. Contudo, de forma particularmente relevante, tumores com mutações no gene KRAS não respondem as estas terapêuticas. Diversas estratégias dirigidas à inibição do KRAS têm sido tentadas, tendo como alvo, tanto a proteína, como as vias moleculares associadas, ou a inibição da tradução do seu RNA mensageiro. No entanto, o vasto espectro mutacional, bem como os efeitos adversos têm impedido que estas alternativas sejam incluídas na estratégias terapêutica utilizada para doentes de CC com KRAS mutado. Existe, assim, a necessidade de encontrar uma nova estratégia molecular que permita atuar de forma eficaz e seletiva neste alvo biológico relevante, superando a dificuldade técnica resultante de perfis fenotípicos distintos desta proteína, originados pela diversidade de mutações na região codificante do gene. Em 2006 foi descrita a presença de um G-quadruplexo de DNA na região promotora do gene KRAS. Posteriormente, em ensaios in vitro e in vivo, foi confirmada a influência desta estrutura na regulação da expressão do gene KRAS que, quando estabilizada por diferentes mecanismos, leva à repressão da expressão. A estabilização deste tipo de estruturas tem sido conseguida através da síntese de ligandos derivados de fluoroquinolonas, indoloquinolinas, porfirinas e telomestatinas. Os estudos apresentados nesta tese tiveram como principal objetivo a avaliação do mecanismo de ação de ligandos, compostos derivados de indoloquinolinas, sintetizados para estabilização do G-quadruplexo presente no promotor do gene KRAS. Foram, assim, realizados ensaios de viabilidade e morte celular, na presença destes ligandos, bem como de efeito no promotor do gene KRAS e de alteração dos níveis de expressão de mRNA e proteína. Para este propósito foram utilizadas as linhas celulares de cancro do cólon HCT116 e SW620 (KRAS mutado) e duas linhas não malignas, HEK293T e CCD18co (KRAS selvagem). Foram sintetizados dez ligandos derivados de indoloquinolinas, dos quais sete ligandos (3e, 3g, 3h, 3m, 13a, 14a e 3c) são derivados de indolo[3,2-c]quinolina e três ligandos (2a, 1a e 2d) são derivados de indolo[3,2-b]quinolina. A seletividade e afinidade destes ligandos para a sequência nuclease hypersensitive polypurine-polypyrimidine element (NHPPE) do promotor do gene humano KRAS (KRas21R), em relação a uma sequência de DNA aleatória que forma um hairpin (T-Loop), foi avaliada através de um ensaio de fluorescence resonance energy transfer (FRET) melting. Os resultados deste ensaios permitiram verificar que todos os ligandos testados apresentaram temperaturas de melting superiores quando ligados à sequência mimética da estrutura de G-quadruplexo do promotor do KRAS, comparativamente com a de T-Loop. Foram realizados ensaios de avaliação de viabilidade celular, com a incubação dos ligandos nas diferentes linhas celulares ao longo de 72 h. Com base nestes ensaios, foram calculadas as concentrações inibitórias 50 (IC50) e 65 (IC65) para cada composto, em cada linha celular. Na sua globalidade, os compostos reduziram a viabilidade celular, sendo que nas linhas de CC HCT116 e SW620, sete dos dez compostos apresentaram valores de IC50 e IC65 inferiores aos registados nas linhas não malignas. Mais ainda, na linha celular HCT116, sete dos dez ligandos mostraram ser mais eficazes na diminuição da viabilidade celular, quando comparados com o 5-FU. Na linha SW620, nove dos dez ligandos foram mais eficazes. Nos ensaios de avaliação de viabilidade e morte celular por citometria de fluxo (Guava ViaCount) foram verificados aumentos consideráveis de células HCT116 mortas, principalmente por apoptose, na presença dos compostos a IC50 e IC65, comparativamente com o controlo de veículo e com a presença de 5-FU em concentração equitóxica (IC50 e IC65). Curiosamente, na linha celular SW620, apenas o composto 3g apresentou resultados interessantes, uma vez que a exposição a uma dose IC65, resultou numa população de ~ 60% células mortas. Os aumentos de morte celular foram acompanhados por um aumento de expressão da proteína p53. Já na linha não maligna, HEK293T, em ambas as concentrações, nenhum dos compostos causou morte significativa, comparativamente com o controlo e com o 5-FU a concentração equitóxica. De seguida, o mecanismo de ação dos compostos foi avaliado através de uma ensaio repórter de luciferase com dois plasmídeos pGL3-basic, em que foi clonada, respetivamente, uma região de 500 (pGL3-Ras0.5) e 2000 (pGL3-Ras0.5) pares de base do promotor do gene KRAS, ambos contendo a região NHPPE, que origina o motivo em G-quadruplexo. Em paralelo utilizámos pGL3-basic (vector vazio) como controlo. Os resultados obtidos nestes ensaios permitiram confirmar que todos os compostos testados atuam no promotor do gene, reprimindo a sua transcrição. Foram também investigados os níveis de expressão de proteína e mRNA do KRAS, para avaliar os efeitos da ligação dos compostos ao promotor do gene. Com base nestes ensaios, foi possível verificar que todos os ligandos reduziram os níveis de mRNA, proteína, ou ambos, numa extensão variável, nas diferentes linhas celulares em que foram testados. Em conclusão, os nossos resultados vêm demonstrar uma maior dependência de sinalização via KRAS nas células cancerígenas, para a sua sobrevivência e proliferação, em comparação com células não malignas. De forma relevante, o presente trabalho demonstrou que a inibição deste oncogene, através da utilização de ligandos específicos para um G-quadruplexo no seu promotor, se apresenta como uma abordagem terapêutica inovadora e com boas perspetivas futuras, merecedora de desenvolvimento com vista a ser utilizada no tratamento de tumores com KRAS mutado.This work was supported by grants by Sociedade Portuguesa de Gastrenterologia and Fundação para a Ciência e Tecnologia (EXPL/QEQ-MED/0502/2012)