Production of therapeutic Plasmid DNA by Lactic Acid Bacteria

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014As vacinas baseadas em DNA plasmídico são uma alternativa mais segura relativamente às tradicionais, podendo ser estes vetores produzidos mais rapidamente e com maior facilidade no geral. Escherichia coli é o hospedeiro mais comum para a produção de vacinas de DNA. Contudo estas bactérias gram negativas possuem na sua membrana externa lipopolissacarídeos, uma endotoxina que se liga a um complexo de recetores CD14/TLR4/MD2, ativando a cascata do complemento e que resulta numa reação inflamatória grave. Assim, este trabalho pretende desenvolver uma alternativa mais segura para as vacinas de DNA em bactérias ácido lácticas uma vez que são comumente utilizadas na indústria alimentar, são consideradas como probióticos e usadas para a expressão de proteínas heterólogas. O crescimento para duas estirpes (Lactococcus lactis LMG 19460 e Lactobacillus plantarum CCUG 61730) foi optimizado em pequena escala (crescimento em falcon), chegando-se à escala de 1 litro de cultura celular em condições anaeróbias. Para o processo de eletrotransformação só o baseado em NaCl foi eficiente para a transformação de L. lactis LMG 19460, não se tendo obtido transformantes para L. plantarum CCUG 61730. Neste trabalho construiu-se um plasmídeo modificado por alteração do Ribosome binding site (RBS) de forma a aumentar o número de cópias de plasmídeo em bactérias lácticas. A quantificação relativa do número de cópias do plasmídeo foi realizada por PCR em tempo real e como análise complementar utilizou-se a quantificação por absorvância a 260nm após purificação do plasmídeo. Embora haja alguma variação, parece existir um aumento do número de cópias do pTRKH3 em L. lactis LMG 19460 em 4 colónias. No entanto para outras colónias este aumento não foi tão evidente. A sequência modificada do RBS foi confirmada por sequenciação para os clones mais produtores e para os restantes. Finalmente, melhorou-se o rendimento de purificação (cerca de 3000%) dos plasmídeos adicionando 10mg/ml de lisozima durante o passo de lise celular.The vaccines based on plasmid DNA are a safer alternative to the traditional. In general plasmid vectors are produced more quickly and easier. Escherichia coli is the most common host strain for production of DNA vaccines. However, these gram-negative bacteria have lipopolysaccharides in the outer cell membrane, which acts as an endotoxin that binds to a complex of CD14/TLR4/MD2 receptors, activating the complement cascade resulting in a severe inflammatory reaction. This work aims to develop a safer alternative to DNA vaccines in Lactic Acid Bacteria since they are commonly used in the food industry, used as a probiotic and also for delivery of therapeutic proteins. The process of growth at small scale has been optimized for strains Lactococcus lactis LMG 19460 and Lactobacillus plantarum CCUG 61730. It was also produced 1 liter in anaerobic conditions. Electrotransformation was achieved with NaCl method only for strain L. lactis LMG 19460. A modified plasmid DNA (pTRKH3) for vaccine with a change in Ribosome binding site (RBS) was produced, in order to increase the copy number of plasmid in Lactic Acid Bacteria. The relative quantification of plasmid copy number was performed by RT-PCR and by absorbance at 260nm after purification by miniprep as a complementary analysis. It was found in four clones of L. lactis LMG 19460 harbouring pTRKH3 an increased plasmid copy number. However, for other colonies this increase was not so evident. Cell disruption and purification process of plasmid DNA was obtained by alkaline lysis. It was achieved much higher amounts (3000%) of purified pDNA after addition of Lysozyme 10 mg / l to cell lysis