Exploiting hnMSC 3D cultures conditioned medium for tissue regeneration

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014Wound healing is impaired in several chronic diseases, where several factors are responsible for non-healing wounds. Over the time, treatment for these disabling conditions remains limited and largely ineffective. Mesenchymal stromal cells are valid candidates for cell therapy due to their beneficial effects on tissue regeneration. Besides these effects that could be mediated by cellular proliferation and differentiation, the secretion of growth factors and cytokines that enhance tissue repair has gained more attention. UCX®, in particular, is a specific population of human neonatal umbilical cord matrix derived MSCs that was found promising in this field and which paracrine mechanisms, for promoting cutaneous healing, have been studied. In this work, UCX® 3D cultures were exploited for conditioned media (CM) production. In contrast to 2D cultures, 3D mimic the complex in vivo environment, thus CM obtained by this methodology is expected to be more efficient in promoting wound healing. CM was obtained from UCX® traditional monolayer (CM2D) and 3D cultures (CM3D) and concentrated up 10x. Cell viability/proliferation assays in keratinocytes (HaCaT) and dermal fibroblasts (HDF), were performed, proving that CM3D and CM2D 10x could be applied in the in vivo assays. In addition, the therapeutic potential of the CM was evaluated in vivo in a rat wound healing model. CM2D and CM3D were applied via subcutaneous injection, to dorsal full-thickness incisions. The wound closure was monitored daily by size measurements. Skin biopsies were also taken at several time points for histological analyses to assess and compare different healing stages. Results showed that CM-treated wounds presented healing enhancement when compared to controls. In particular, CM3D-treated wounds have an improvement of wound healing profile with regards to accelerated wound closure, re-epithelialization and granulation tissue formation. Overall, these results indicate that UCX®-derived CM from 3D cultures may have a place in novel therapies for skin regeneration.A biologia das células estaminais é uma das áreas mais estudadas nos últimos anos. O imenso potencial atribuído a estas células continua a ser motivação para muitos investigadores. De facto, quando se descobrir e perceber o seu funcionamento, as aplicações terapêuticas serão vastas e inovadoras. A definição de célula estaminal baseia-se em três parâmetros [1]. Primeiro, as células estaminais têm de ter a capacidade de se autorrenovarem ao longo de toda a vida, isto é, assegurarem a divisão contínua a fim de manterem uma população de células indiferenciadas [1–4]. O segundo parâmetro está relacionado com a capacidade das células se diferenciarem dando origem a uma progenia especializada [1–2]. Neste ponto, o estádio de potência das células é o fator limitante para o destino a seguir. Por último, uma célula estaminal deve ser competente para repovoar o tecido no qual reside, em caso de lesão do mesmo [1–2]. Todos os tecidos contêm células que satisfazem estas premissas [5], contudo a taxa a que estas células os renovam, varia [1]. Ao longo do desenvolvimento embrionário, as células experienciam diferentes graus de estaminalidade. Até à terceira clivagem, os blastómeros são totipotentes, capazes de originar qualquer célula do organismo; após a mesma, apenas se encontram células pluripotentes que ao serem isoladas a partir do botão embrionário, se conhecem como células estaminais embrionárias (CEE) [2, 4, 6]. Depois do nascimento, as células estaminais existentes, designadas por células estaminais adultas, têm maior especificidade pelo que em princípio, originam células de um determinado órgão ou tecido [4, 6]. No entanto, há evidências de alguma plasticidade, nomeadamente nas células estaminais mesenquimais (CEM) [4, 7], que são células estaminais multipotentes capazes de diferenciar nos vários tecidos da mesoderme e que podem ser isoladas a partir de um largo número de tecidos quer neonatais, como sejam a placenta [8] ou o sangue [9] e a matriz do cordão umbilical [10], quer adultos, como por exemplo, a medula óssea, o músculo, ou o tecido adiposo [11–12]. As células estaminais mesenquimais foram caracterizadas pela Sociedade Internacional para a Terapia Celular, como sendo células capazes de aderir a superfícies plásticas, quando em condições normais de cultura celular; expressar os marcadores de superfície CD105, CD73 e CD90, não apresentando CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79α ou CD19 e HLA II; e de serem competentes na diferenciação em osteoblastos, adipócitos e condroblastos [13]. A facilidade de isolamento não controverso e a dispensa de células de suporte, como precisam as CEE [1], assim como a ultrapassagem da instabilidade genética subsequente da cultura de células pluripotentes induzidas [14], fazem das CEM, um vantajoso alvo de interesse científico. Nomeadamente, as CEM apresentam uma extraordinária capacidade de replicação in vitro traduzindo-se num ponto a favor das terapias celulares, visto necessitarem de grande número de células [1]. A competência das CEM em modular o sistema imunitário assim como a propriedade anti-inflamatória [1, 15] despertaram interesse clínico ao nível, por exemplo, da doença enxerto contra o hospedeiro, comum em transplantes de medula óssea [15–16]; e de outras doenças autoimunes [17–18]. Outra das propriedades apontadas a estas células tem que ver com o seu tropismo para migrar especificamente para locais lesionados onde a interação com outras células promove a diferenciação e libertação de fatores pró-regeneradores do tecido [1]. A capacidade de diferenciação particular das CEM também tem sido evidenciada nomeadamente em mioblastos [19], hepatócitos [20] ou neurónios [21]. Apesar de todas estas propriedades, as CEM têm demonstrado apetência para induzir a regeneração de tecidos sem que seja necessário o seu transplante nem diferenciação [22–23]. Neste sentido, foi proposto que estas células secretam citocinas e fatores de crescimento que promovem a reparação e regeneração de tecidos lesionados de forma mais eficiente, através de ação parácrina das células circundantes [22, 24]. Estesbiofatores secretados suprimem localmente o sistema imunitário, inibem a fibrose e a apoptose e ainda, impulsionam a angiogénese [22]. A pele, em particular, representa uma barreira contra o ambiente externo ao organismo evitando dessa forma a entrada de agentes patogénicos. São igualmente sua função a regulação da temperatura corporal e a prevenção da desidratação [25–27]. Dadas as suas funções, cruciais à sobrevivência do organismo, a sua capacidade de regeneração é de extrema importância. A cicatrização da pele consiste em três fases que, embora distintas, não são independentes: inflamação, proliferação e remodelação [25, 28]. Várias atividades celulares reguladas por diversos fatores parácrinos, como migração e proliferação celulares, nomeadamente de queratinócitos e fibroblastos, representam passos essenciais para a re-epitelização e formação do tecido de granulação, com subsequente vascularização, todos processos inerentes ao sucesso da cicatrização na pele [27–29]. Uma vez que o processo de cicatrização se caracteriza como complexo, o seu sucesso é prejudicado em diversas patologias, como a diabetes e insuficiência renal crónica, resultando em complicações [30]. Assim, novas estratégias têm sido estudadas nomeadamente a aplicação de fatores de crescimento e células estaminais, para promover a cicatrização/regeneração [31]. Neste trabalho, CEM neonatais humanas (CEMnh) isoladas a partir da matriz do cordão umbilical (UCX®; ECBio, PCT/IB08/54067), cuja ação parácrina sugere que estas secretam fatores pró-mitogénicos e motogénicos que induzem a regeneração cutânea [32], foram avaliadas no sentido de promoverem a cicatrização da pele. As UCX® são normalmente cultivadas em culturas bidimensionais (2D), no entanto, estas condições podem eventualmente conduzir à perda de capacidades das células [33], além de estarem longe do ambiente in vivo, melhor representado em sistemas tridimensionais (3D). De facto, as culturas 3D de CEM têm ganho maior destaque [33–37], nomeadamente por aumentarem o seu potencial terapêutico [33–34]. De entre estes modelos, optou-se por culturas em frascos de agitação onde as células se agregam em esferoides, permitindo interações célula-célula e célula-matriz extracelular, que podem influenciar a atividade de sinalização das células [33–35]. Assim, juntando o potencial parácrino das UCX® com os modelos de cultura 3D apresenta-se uma nova abordagem para o melhoramento das características destas células para a terapêutica de regeneração da pele. Neste contexto, o objetivo deste trabalho consistiu na avaliação do potencial terapêutico do meio condicionado produzido por culturas 3D de UCX® na cicatrização cutânea, através das propriedades secretoras destas células. Neste sentido, foi produzido meio condicionado por esferoides de UCX® cultivadas em frascos de agitação (CM3D). Uma vez que as células são adaptadas a condições de cultura sem soro, o diâmetro e a morfologia dos agregados foi monitorizado ao longo do tempo de cultura, no sentido de se garantir a manutenção de células viáveis em cultura e evitar a formação de centros necróticos. Verificadas estas condições, as mesmas foram utilizadas para a produção de CM3D, utilizado posteriormente em ensaios in vitro de viabilidade celular e ensaios in vivo utilizando o modelo de ferida. Para determinar o efeito do meio condicionado (CM) na viabilidade/proliferação celular bem como definir a concentração a ser aplicada nos ensaios in vivo, realizou-se uma curva dose-resposta. A citotoxicidade do CM3D, bem como a do meio condicionado derivado de culturas em monocamada de UCX® (CM2D) foi avaliada em tipos celulares da pele, nomeadamente, fibroblastos dérmicos e queratinócitos. Em geral, os resultados mostraram ausência de citotoxicidade de CM3D em ambos os tipos celulares. Além disso, verificou-se que o CM3D induziu a proliferação de queratinócitos numa vasta gama de concentrações (0,5x; 1x; 3x; 6x), enquanto apenas as mais altas (3x, 6x, 10x) aumentaram a proliferação de fibroblastos. Por outro lado, CM2D 10x não teve impacto na viabilidade de fibroblastos e queratinócitos, no entanto, em baixas concentrações (0,5x; 1x, 3x) mostrou reduzir a viabilidade dos fibroblastos. Desta forma, CM concentrado 10x foi adotado para os ensaios in vivo. O modelo de ferida utilizado foi descrito como prevenindo a contração da pele, pelo que permite que a cicatrização ocorra essencialmente pelos processos de granulação e re-epitelização, tal como acontece na espécie humana. Assim, os efeitos do CM em contexto de ferida foram testados no modelo animal de rato. Em cada animal, foram realizadas quatro feridas no dorso, sendo que cada ferida foi tratada separadamente com CM2D, CM3D, meio de controlo (veículo) ou deixada a cicatrizar ao ar (controlo). Os efeitos foram avaliados macroscopicamente através de medições da ferida e microscopicamente por análise histológica. Os resultados mostraram que feridas tratadas com CM apresentam uma clara aceleração do fecho de ferida, sendo que as feridas tratadas com CM3D fecharam em média ao dia 12 e as feridas de controlo ao ar nunca fecharam antes do final do ensaio (dia 14). Histologicamente, a melhoria significativa da cicatrização observou-se a partir do dia 9, com especial relevância ao nível da re-epitelização, da presença de tecido de granulação, da vascularização e da distância entre as margens da ferida. Ainda de referir que enquanto as feridas tratadas com CM2D e CM3D não apresentaram diferenças significativas macroscopicamente, cortes histológicos das feridas ao dia 14 revelaram um tecido completamente regenerado no caso do CM3D e um tecido ainda com resquícios de tecido de granulação nas feridas CM2D. Os resultados demonstram que CM provenientes de diferentes modelos de cultura de UCX® têm efeitos distintos no que respeita a viabilidade e proliferação celulares, bem como no processo de cicatrização da pele, sugerindo que o secretoma destas células varia de acordo com as suas condições de cultura. Em especial, CM3D demonstrou promover uma melhoria no perfil de regeneração cutânea. Deste modo, evidenciou-se que CEMnh podem ser uma fonte de fatores parácrinos com um importante efeito na cicatrização cutânea e que a sua cultura em modelos 3D, poderá introduzir o CM3D como potencial terapêutica na regeneração de tecidos