Functional characterization of virulence-associated Trimeric Autotransporter Adhesins from the human pathogen Burkholderia cenocepacia

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014O complexo Burkholderia cepacia (Bcc) é constituído por, pelo menos, 18 espécies do género Burkholderia, estas bactérias são agentes patogénicos oportunistas capazes de causar infeções severas e, frequentemente, morte em doentes com fibrose quística (CF). A fibrose quistica é provocada pela mutação do gene codificante do regulador de condutância transmembranar (CFRT) que causa a sua ausência na membrana apical das células epiteliais. Esta doença é caracterizada pela inflamação e infeção crónica das vias respiratórias por Pseudomonas aeruginosa e Burkholderia cepacia. Agentes patogénicos como B. cepacia apresentam muitos fatores de virulência que os ajudam a estabelecer infeção e a invadir células hospedeiras. Entre os muitos fatores já estudados estão as adesinas triméricas autotransportadas (TAAs). Estas proteínas são responsáveis pela adesão às células hospedeiras e, também pela formação de biofilme, invasão e sobrevivência destas bactérias dentro de células hospedeiras. Estas adesinas são o único mecanismo de aderência a células hospedeiras conhecido em Burkholderia, para além da adesina de 22KDa associada a pili, também já estudada. No entanto, apesar de já demonstrada a importância das TAAs para capacidade de adesão e invasão de B. cenocepacia a porta de entrada utilizada por estes patogéneos ainda não é conhecida, e, por isso, neste trabalho as jangadas lípidicas foram estudadas como uma possível opção. A análise do genoma da estirpe B. cenocepacia J2315 revelou a existência de um agrupamento de genes no qual a lipoproteína de membrana BCAM0220 e da adesina BCAM0219 formam um operão, sugerindo, portanto, a assistência da lipoproteina na biogénese da adesina BCAM0218, como o já estudado entre as proteínas SadA e SadB em Salmonella. Neste trabalho foi possível perceber que as jangadas lípidicas não são utilizadas como portas de entrada na ligação das TAAs na infeção de células epiteliais por B. cenocepacia. No entanto, não foi possível estudar a sugerida relação entre as proteínas BCAM0220 e BCAM0219, pois as ferramentas necessárias não foram obtidas.The Burkholderia cepacia complex (Bcc) comprises, at least, 18 species of the Burkholderia genus, these bacteria are opportunistic pathogens able to cause severe and often lethal respiratory infections in cystic fibrosis (CF) patients. CF is a genetic disorder that causes the lack of the transmembrane conductance regulator (CFRT) protein at the apical membrane of epithelial cells. This disease is characterized by chronic airway infection, which can be caused by a variety of microorganisms, such as Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia, and persistent airway inflammation. Pathogenic bacteria, as Burkholderia bacteria possess a vast array of virulence determinants that are used to cause infection. Although, pathogenicity in these bacteria is still poorly understood many virulence determinants have already been described, among them there are the trimeric autotransporter adhesins (TAAs). The TAAs are responsible for not only adherence, but biofilm formation, invasion and survival within eukaryotic cells, as well. Additionally, the only other virulence factor responsible for adhesion already described in Burkholderia is the 22KDa cable pili associated adhesin. Previous studies demonstrated that TAAs are necessary for B. cenocepacia's ability to adhere and invade airway epithelial cells, nevertheless, the gateways that these bacteria use to do so have yet not been described, therefore, in this study, lipid rafts were exploited as a possibility. Furthermore, the study of the genome of the B. cenocepacia J2315 strain revealed the existence of a putative adhesin cluster in which the TAA BCAM0219 gene and the outer-membrane lipoprotein BCAM0220 are an operonic structure suggesting a possible assistance of the BCAM0220 lipoprotein in BCAM0219 TAA biogenesis, as it has been described for the SadA and SadB Salmonella proteins. In this study, it was possible to determine that lipid rafts are not used as gateways, but, unfortunately, it was not possible to study BCAM0220 and BCAM0219 interaction as the necessary tools were not obtained