Characterisation of a novel family of putative Glutamate Receptor-like interacting proteins in Arabidopsis thaliana

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014CORNICHON proteins (CNI) form a conserved family of cargo receptors, found in almost all eukaryotes. Besides their most ancestral role as trafficking mediators of transmembrane proteins, some CNI homologs (CNIH) evolved specific interactions with ionotropic glutamate-receptors (iGluR) by being part of the channel complex, regulating iGluR’s gating properties at the membrane. Since Arabidopsis encodes five CNIHs and 20 glutamate receptor-like (GLR) proteins, the present work aimed to characterise AtCNIH’s function as well as to assess a putative GLR-CNIH interaction. The five AtCNIH genes present a similar genetic structure characterised by four exons with the 2nd and the 3rd very conserved in size, probably encoding for motifs with importance for AtCNIH’s function. Phylogenetically, AtCNIHs diverged into two different clusters, one sub-grouping AtCNIH2-5 with homologs of the most ancient plants and the other comprising AtCNIH1, which - strikingly - exclusively groups with angiosperm CNIHs, suggesting a divergent evolution within that plant division. Moreover, phenotypic analyses were carried out in many developmental stages of Arabidopsis. Seeds from cnih1 and cnih5 mutants showed a decreased size and weight, with repercussions on the germination rate. In roots, cnih mutants presented an impaired growth, except for cnih3, demonstrating that presumably all CNIHs play a role in root development. However, in ion imbalanced media cnih1 mutants showed not only the shortest roots but also a different growth profile, indicating the essential role of this isoform in roots. Furthermore, cnih mutants grown in short-day conditions showed a delay in flowering time. Subcellular localisation studies revealed that AtCNIHs are resident proteins of the ER. This localisation was also shown for homologs from other organisms, thereby being suggestive of a similar role for the plant CNIHs. As the GLR-CNIH interaction studies accomplished in this work did not allow conclusive interpretations, further experiments are needed to characterise their degree of interaction.Em todos os momentos da vida de uma planta, o seu desenvolvimento depende da complexa integração tanto de estímulos endógenos, como ambientais. Estes sinais serão interpretados, originando uma resposta coordenada, no tempo e espaço, precedente aos vários processos indispensáveis à morfogénese, crescimento e diferenciação do organismo. Muitas destas respostas são despoletadas pelo ião de Cálcio (Ca2+), visto este estar integrado em vias de transdução de sinal, actuando como segundo mensageiro. Assim, a sinalização de Ca2+ está na base da regulação de múltiplos processos fisiológicos, tais como respostas a stress abiótico, abertura estomática, auto-incompatibilidade durante a fertilização, interacção com agentes patogénicos e organismos simbiontes, regulação dos ritmos circadianos, e o desenvolvimento de estruturas com crescimento apical, como são os pelos radiculares e tubos polínicos. Apesar da entidade molecular responsável pela iniciação destes sinais de Ca2+ estar ainda por aferir, um candidato provável ao desempenho de tais funções é a família dos genes Receptores de glutamato de plantas (GLRs). Os GLRs são homólogos dos receptores de glutamato ionotrópicos (iGluR), presentes no sistema nervoso dos vertebrados e invertebrados, tendo um papel fulcral na regulação da transmissão sináptica, sendo canais iónicos permeáveis a Ca2+. Estudos recentes em rato identificaram um novo nível de regulação dos iGluR por proteínas CORNICHON homólogas (CNIH). Para além do seu papel fundamental como proteínas chaperonas, mediando o tráfego de proteínas membranares na via secretória, as CNIHs também integram a estrutura dos iGluR, na membrana plasmática. Devido à sua interacção com iGluR, CNIHs regulam as propriedades eletrofisiológicas destes canais, assim como o número destes que se encontram distribuidos na membrana. Surpreendentemente, cinco proteínas CNIH foram descobertas em Arabidopsis e, uma vez que o seu genoma codifica 20 GLRs, é objectivo do presente trabalho caracterizar quais as funções fisiológicas em que as CNIHs estão envolvidas, bem como compreender se a interacção GLR-CNIHs evoluiu também em plantas. Para responder a estas questões foram utilizados como principais ferramentas plantas Arabidopsis mutantes e análise filogenética. Análises das sequências de DNA mostraram que os cinco genes parálogos AtCNIHs em Arabidopsis apresentam uma estrutura genética bastante conservada, em que o segundo e terceiro exões são iguais em tamanho. A conservação destes dois exões pode ser explicada pelo facto de conter o motivo cornichon. Este domínio proteico, é característica estrutural das proteínas CNIH e está muito provavelmente, envolvido na afinidade para interacção com as proteínas transportadas. De acordo com modelos que prevêem a topologia das proteínas transmembranares, todos os parálogos AtCNIHs, com excepção de AtCNIH2, codificam uma proteína com 3 domínios transmembranares (TMD), à semelhança de muitas das CNIHs presentes em outros organismos. Contrariamente, AtCNIH2 apresenta uma delecção no primeiro exão, o que faz com que a proteína que codifica apenas contenha 2 TMD. Uma vez que este trabalho se foca no papel fisiológico e funcional das AtCNIHs, as sequências de proteínas foram analisadas de modo a construir uma matriz de identidade e similaridade, sendo realizada uma análise filogenética. De acordo com a filogenia, AtCNIH1 terá divergido dos restantes parálogos, agrupando-se num clade com as CNIHs das plantas angiospérmicas analisadas, padrão que sugere uma evolução específica dentro desta divisão de plantas. O segundo grande clade compreende os restantes parálogos AtCNIH2-5, bem como a maioria das CNIHs de todos os taxa sob análise. Neste clade estão também contidas as linhagens de plantas mais basais, como o musgo P. patens, o que indica que as CNIHs presentes poderão ter evoluído para realizar um papel especializado em mecanismos transversais à biologia de todas as células vegetais, enquanto AtCNIH1 terá evoluído especificamente em angiospérmicas. Os mutantes cnihs foram analisados, ao nível fenotípico, em vários estágios do ciclo de vida da Arabidopsis. Em sementes, cnih1 e cnih5 foram os genótipos mais afectados, apresentando redução de tamanho e peso da semente. Consequentemente, a germinação foi influenciada em ambos, sendo cnih1 mais afectado, apresentando uma redução superior a 50% da taxa de germinação, comparativamente à redução de 30% apresentada por cnih5. Estes resultados sugerem que o desenvolvimento do embrião poderá ser afectado, e os nutrientes do endosperma reduzidos, contribuindo assim para o fenótipo observado na semente. cnih3 foi o único mutante a não expressar efeitos deletérios nos fenótipos observados e, apesar de cnih4 apresentar sementes mais pequenas e leves, não houve influência na taxa de germinação deste mutante. Uma vez que AtCNIH3 e AtCNIH4 são genes filogeneticamente muito próximos, e as proteínas que codificam apresentam altos valores de identidade e similaridade, é provável que exista compensação funcional destas duas proteínas, tornando imperceptíveis alterações fenotípicas mais pronunciadas. Em plântulas, foram observadas as raízes, para aferir como a perda de função das AtCNIHs afecta o crescimento deste órgão altamente organizado. Todos os mutantes cnih, com excepção de cnih3, demonstraram crescimento radicular debilitado, o que indica que as CNIHs influcenciam o desenvolvimento típico das raízes. No entanto, quando expostas a meios de crescimento desequilibrados ionicamente, foi o mutante cnih1 que se destacou, apresentado um perfil de crescimento diferente dos restantes genótipos nestes mesmos meios. Este resultado sugere que a proteína AtCNIH1 poderá estar envolvida na interacção com canais membranares que regulam o equilíbrio iónico, e a homeostasia celular das raízes com o substrato. Ademais, foi analisado o modo como o fotoperíodo influencia o processo de floração no crescimento das plantas mutantes. Sob condições de dia longo, nenhum dos genótipos mostrou diferenças morfológicas. Porém, quando expostas a condições de dia curto, todos os genótipos foram influenciados. Os mutantes cnih1 e cnih4 mostraram um atraso de 3 semanas no crescimento de estruturas reprodutivas, enquanto cnih3 e cnih5 aproximadamente 1,5 semanas. Dados sobre os níveis de expressão de mRNA de AtCNIHs revelaram que enquanto CNIH1 é expressa independentemente do período do dia, CNIH3 e CNIH4 sofrem um aumento de expressão durante o período nocturo, de maneira oscilatória. Isto sugere que as proteínas CNIH3 e CNIH4 estão envolvidas em processos de percepção de pistas ambientais fóticas, e da duração do dia, sinais essenciais para a indução de crescimento apical e desenvolvimento dos tecidos reproductivos. CNIH1 poderá estar envolvida em processos mais complexos e transversais ao desenvolvimento da raiz. Estudos de localização celular em protoplastos revelaram que AtCNIH1, AtCNIH3 e AtCNIH4 são proteínas residentes do Retículo Endoplásmico (ER). A sua localização no ER é coincidente com a localização celular das CNIHs noutros organismos, o que sugere que AtCNIHs têm provavelmente uma função conservada como chaperonas, mediando o tráfego de proteínas e controlando a exportação das mesmas. Esta função não pôde ainda ser demonstrada devido a complicações experimentais na expressão transiente de AtGLRs fundidas com GFP. Assim, não foi possível aferir se AtCNIHs evoluíram especificamente para interagir com AtGLRs, como reportado anteriormente em estudos com animais, ou se esta interacção é característica geral de todas as AtCNIHs. O presente estudo, apresenta-se como a primeira abordagem às funções de CNIHs em plantas. Apesar da interacção com outras proteínas não ter sido corroborada, a análise fenotípica assim o indica, uma vez que a mutação destas proteínas resultou em alterações fenotípicas em todo o organismo, muitas vezes drásticas, afectando diferentes fases do desenvolvimento, que teriam certamente influência na fitness dos mesmos. Estudos futuros são necessários para precisar o nível de interacção de AtCNIHs com AtGLRs e outras proteínas, para assim abrir caminho a estudos de tráfego celular e regulação de proteínas na via secretória, em células vegetais