Morphological, ultramorphological and molecular preliminary evaluation of midwest Portuguese populations of Rhipicephalus sanguineus sensu lato

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014As carraças (Ordem Ixodida: Classe Arachnida) são artrópodes hematófagos estritos e ectoparasitas de uma grande variedade de vertebrados terrestres com uma grande importância médica e veterinária pois, para além de poderem causar lesões aos seus hospedeiros devido à sua acção hematófaga, podem também transmitir vários agentes patogénicos aos seus hospedeiros. Encontram-se vasta e mundialmente distribuídos, apesar de se concentrarem especialmente nas regiões mais temperadas do planeta. Embora sejam caracterizados como vectores de zoonoses, são várias as espécies de carraças associadas à transmissão de agentes patogénicos ao Homem responsáveis pelo aparecimento de diversas doenças infecciosas como rickettsioses, ehrlichioses, febre botonosa, leishmaniose, entre outras patologias. A determinação e diferenciação de espécies de ixodídeos são tradicionalmente baseadas em características morfológicas, ecológicas e biológicas dos espécimes em estudo. Infelizmente, estas metodologias são substancialmente limitadas, não só pela presença de variações inter e intraespecíficas, como pela existência de grandes semelhanças ecológicas, biológicas e geográficas, dificultando assim o diagnóstico. Com o desenvolvimento de técnicas de biologia molecular, como a reacção de polimerase em cadeia (RPC) a análise de marcadores específicos no ácido desoxirribonucleico (ADN) dos ixodídeos permite detectar e evidenciar a variabilidade inter e intraespecífica e, assim, obter informação que permita distinguir os diferentes polimorfismos que caracterizam as diferentes espécies de carraças. Dentro das três famílias de ixodídeos existentes no mundo, é a família Ixodidae (carraças de corpo duro) a que tem maior importância médica/veterinária, devido ao grande número de espécies nela incluída ligada à transmissão de agentes patogénicos. Esta inclui o género Rhipicephalus (Subfamília Rhipicephalinae), um dos considerados mais controversos em termos taxonómicos e, simultaneamente, dos mais distribuídos mundialmente. A espécie Rhipicephalus sanguineus (originalmente descrita por Latreille em 1806) é uma das 84 espécies do género, e apresenta uma grande diversidade morfológica intraespecífica, a qual tem sido assinalada por vários autores. Ela encontra-se incluída e é o holótipo do designado grupo ou complexo R. sanguineus (R. sanguineus sensu lato), que inclui pelo menos 11 espécies (3 delas assinaladas em Portugal) que apresentam diversas parecenças biológicas e morfológicas. Entre elas está incluída a espécie R. turanicus, a qual é considerada a mais similar à espécie R. sanguineus sensu stricto, sendo inclusivamente consideradas como uma única espécie presente em Portugal por alguns autores. O diagnóstico preciso é importante nestes artrópodes, já que diferentes espécies apresentam diferentes capacidades vectoriais na transmissão de agentes patogénicos, e suspeita-se que a espécie R. sanguineus seja o que tem maior interação com o homem. Em Portugal, esta espécie já foi detectada de norte a sul do país, e é responsável pela transmissão de diversos agentes patogénicos, entre os quais Babesia canis (causa babesiose canina), Ehrlichia canis (causa ehrlichiose canina) e Ricketsia conorii (causa de febre escaro-nodular ou botonosa no homem). É então de importância médica e veterinária aumentar o conhecimento científico relativamente a aspectos de caracterização morfológica, taxonómica e genética das populações portuguesas destas carraças como vectores, de forma a melhor compreender os aspectos biológicos, ecológicos e epidemiológicos destas carraças no país, sendo um tema com interesse económico e de saúde pública. Assim, realizou-se um estudo preliminar morfológico e filogenético da espécie R. sanguineus sensu lato colectadas em cães provenientes de três concelhos portugueses: Óbidos, Caldas da Rainha e Santarém. Este estudo foi feito em quatro fases: a análise morfológica via microscopia estereoscópica baseada na avaliação tradicional dos espécimes e na classificação mais recente da variedade do grupo R. sanguineus, a análise estatística de caracteres morfológicos considerados dos mais discriminatórios com vista na formação de grupos de semelhança (Análise Hierárquica de Clusters), análise ultramorfológica por microscopia electrónica de varrimento (MEV) baseada na classificação taxonómica mais recente da variedade do grupo R. sanguineus, e pela análise molecular baseada no marcador de ADN mitocondrial citocromo c oxidase I (COI). Os resultados obtidos com todas as metodologias mencionadas excepto a análise molecular que não foi conclusiva, e após comparação, permitem-nos concluir e confirmar que existe uma grande variedade morfológica relativa à espécie R. sanguineus s.l. nas populações portuguesas estudadas, sendo que a presença da espécie R. turanicus em Portugal é fundamentada, e é sugerida assim uma nova classificação segundo semelhanças taxonómicas observadas no grupo. Assim sendo, nos machos obtiveram-se 8 grupos morfologicamente distintos, dos quais 4 não descritos na mais recente classificação morfológica para R. sanguineus. Por outro lado, obtivemos 7 grupos morfológicos para as fêmeas, não tão distintos quanto os dos machos, dos quais 4 não descritos também na mais recente classificação morfológica para R. sanguineus. É também sugerido o uso futuro da metodologia estatística empregue como técnica de avaliação da variabilidade morfológica de uma população, já que esta se provou um auxiliar poderoso no que toca a avaliação da variabilidade presente dentro de uma população em estudo.Rhipicephalus sanguineus, commonly known as “brown dog tick” or “kennel tick”, is a three-host tick that parasitizes mainly dogs and occasionally humans. This arthropod is worldwide distributed and is a vector of some zoonosis, as Rickettsia conorii (pathogen of Mediterranean spotted fever). In Portugal, R. turanicus present high morphological resemblances to R. sanguineus, and as both populations are sympatric and very genetically similar, are easily misidentified. However, through a careful morphological analysis, it is possible to distinguish them, especially by the use of electronic microscopy. Although some prior molecular and morphological studies have already been performed on these Portuguese populations, the results differ, which means there is still much speculation and disagreement around this taxonomic classification. In this context, this study was conducted using morphological (stereoscopic microscopy), ultramorfological (scanning electron microscopy - SEM) and molecular analysis (COI was the molecular marker of choice) in order to clarify the taxonomic status of these populations. For that purpose, three R. sanguineus s.l. populations collected from the districts of Óbidos, Santarém and Caldas da Rainha were used. The species identification was performed based on morphology characteristics, using standard taxonomic keys (Dias, 1994; Papadopoulos et al., 1992; Walker et al., 2003). Ticks that could not be morphological identified as R. sanguineus or R. turanicus were defined as intermediate species. Some R. pusillus specimens were included in the analysis as an out-group. The results obtained with the mentioned methods (except for the molecular analysis), allowed to conclude that there is a great morphological diversity within R. sanguineus s.l. Portuguese populations, and that the presence of R. turanicus in Portugal is grounded. Thus, it is suggested a new taxonomic classification based in observed variability within the group. It also suggested the future use of the statistical methodology employed as a technique for morphological variability evaluation within a representative population