Development of nanosystems for HIV vaccine delivery

Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2014Objetivo: Apesar dos avanços alcançados nas terapêuticas atuais, o desenvolvimento de vacinas profiláticas, seguras e altamente imunogénicas para controlar e erradicar o vírus da imunodeficiência humana (HIV) continua a ser uma das tarefas mais exigentes e desafiantes. Para prevenir a infeção por HIV, as células apresentadoras de antigénio (APCs) altamente especializadas, têm de induzir respostas imunitárias humorais e celulares eficazes. Mais especificamente, a indução de anticorpos neutralizantes específicos contra o vírus (nomadamente as imunoglobulinas (Ig)G, IgA e IgE) secretados pelos linfócitos B, especialmente no local de entrada do vírus (resposta tipo Th2), e a estimulação de linfócitos T citotóxicos juntamente com uma resposta do tipo Th1 parecem ser cruciais para travar a disseminação deste vírus. Deste modo, a persistência da infeção por HIV parece estar intimamente associada à inadequada estimulação de uma resposta imunológica eficaz e específica capaz de destruir o vírus. Esta resposta é bastante complexa, não existindo uma correlação directa entre a infeção por este agente e eventuais mecanismos de proteção ou controlo da disseminação da doença. O HIV liga-se ao receptor CD4 via glicoproteína gp120 do invólucro viral, a qual sofre uma alteração conformacional, facilitando a sua ligação a um dos dois co-recetores de referência, CCR5 ou CXCR4. A interação da gp120 com o recetor CD4 e os co-recetores é vital para que o vírus se ligue à célula. Contudo, para finalizar o processo de infeção vírus-célula, a glicoproteína gp41 do invólucro viral terá posteriormente de interagir com um recetor de fusão na célula. Após a fusão, o conteúdo viral é libertado para o interior da célula com a subsequente transcrição do RNA viral em DNA, que será transportado até ao núcleo e integrado no genoma celular, sendo posteriormente traduzido em proteínas. Estas proteínas virais, juntamente com o RNA viral, são transportados para a superfície celular iniciando a formação de novos viriões maduros. Os linfócitos T e B, os macrófagos e as células dendríticas (DCs) podem expressar os co-recetores CCR5 ou CXCR4, estando portanto suscetíveis à infeção por HIV. No entanto, apenas as DCs podem ligar-se à glicoproteína gp120 sem que haja fusão membranar. As DCs são atualmente reconhecidas como entidades fundamentais para a estimulação de uma resposta imunológica robusta e específica contra o HIV, a qual se deve à sua capacidade de migração para os órgãos linfáticos, zonas ricas em linfócitos T, onde apresentarão os antigénios fagocitados e consequentemente levarão à estimulação dos linfócitos T CD4+ e CD8+, promovendo um eficiente e prolongado controlo da replicação do vírus no hospedeiro. No entanto, o papel destas APCs na imunologia do HIV está longe de ser um tema consensual. Estas células podem capturar, processar e apresentar o HIV desencadeando uma resposta eficaz e específica. Contudo, uma vez infetadas, as DCs podem infetar os linfócitos T, promovendo a disseminação do vírus e a progressão da doença. A fase crónica e assintomática da doença é caracterizada por um decréscimo da carga viral, persistindo o vírus latente em tecidos extravasculares, nódulos linfáticos, DCs e nos linfócitos T CD4+. Embora seja reconhecido o papel dos linfócitos T no controlo da infeção crónica por HIV-1, a imunidade especificamente induzida contra este microrganismo decresce após períodos prolongados da supressão do vírus, não conseguindo controlar a replicação do vírus e consequentemente originando a progressão da doença. Apesar destes doentes serem tratados com medicamentos antiretrovirais, reconhecidos como a melhor opção terapêutica atualmente disponível, estes tratamentos são dispendiosos, apresentam efeitos secundários significativos inerentes à sua toxicidade, dificultando a adesão à terapêutica por parte do doente por longos períodos. Mesmo na presença de medicamentos antiretrovirais, o vírus permanece latente no organismo em níveis não detetáveis, nomeadamente em linfócitos T CD4+ memória. Estes estão inativos, constituindo reservatórios que protegem o vírus da resposta imunológica e da terapêutica antiretroviral, tornando praticamente impossível a eliminação total do vírus com as abordagens terapêuticas actualmente disponíveis. O desenvolvimento de vacinas preventivas e de abordagens imunoterapêuticas contra a infeção por HIV tem sido bastante dificultado pela complexidade dos mecanismos imunológicos associados. De fato, a mutação do vírus, a capacidade deste ultrapassar a resposta imunológica humoral, bem como a manipulação das APCs evitando a maturação destas e portanto a eficaz apresentação dos antigénio aos linfócitos T, têm contribuído para a falta de eficácia obtida por inúmeros candidatos. Deste modo, torna-se desejável o desenvolvimento de novas estratégias capazes de modelar a resposta imunológica contra a infeção por HIV. As nanopartículas (NPs) poliméricas constituem sistemas promissores para o transporte de antigénios HIV-1. De fato, estes nanosistemas protegem os antigénios de HIV-1 das condições desfavoráveis após a sua administração e podem atuar como adjuvantes, aumentando o reconhecimento e a internalização de antigénios pelas DCs. Assim, este projeto único e inovador tem como objetivo criar uma vacina contra o HIV-1 através da encapsulação dos péptidos antigénicos inibidores de fusão do HIV-1, derivados da sequência da região helicoidal adjacente ao C-terminal da gp41, T20 e T1249 em NPs poliméricas. É importante referir que estes péptidos de HIV-1 nunca foram associados a partículas poliméricas. Materiais e Métodos: As NPs poliméricas foram preparadas utilizando o método de dupla emulsão com a evaporação do solvente. O álcool polivinílico, o co-polímero Pluronic® F127 e o glicol quitosano foram incluídos na formulação da vacina para promover o seu potencial efeito adjuvante e/ou aumentar a estabilidade das NPs. O antigénio modelo ovalbumina e os péptidos de HIV-1 gp41, T20 e T1249, foram incorporados ou co-incorporados nas NPs. A caracterização da NPs foi realizada tendo em conta o tamanho, a carga e morfologia da sua superfície por Dispersão Dinâmica de Luz, Dispersão Electroforética da Luz e Microscopia de Força Atómica, respetivamente. A eficiência de incorporação (EE, % (w/w)) e capacidade de carga (LC, μg/mg) dos agentes incorporados foram quantificados por MicroBCA®, Cromatografia Líquida de Alta Eficiência e fluorescência. As DCs foram usadas para avaliar a citotoxicidade in vitro das NPs através do ensaio AlamarBlue® e a captura e tráfego intracelular das NPs marcadas com rodamina foram estudados por microscopia confocal. A integridade da estrutura dos péptidos foi ainda confirmada por electroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes, utilizando o dodecil sulfato de sódio. Resultados: As NPs apresentaram diâmetros médios compreendidos entre 170-180 nm, com uma distribuição de tamanhos restrita (PdI < 0,15), carga superficial próxima da neutralidade e forma esférica. Estes sistemas de transporte de antigénios apresentaram elevados EE e LC, e nenhum efeito citotóxico em DCs, na gama de concentrações testadas (0,125-1 mg/mL), após 24, 48 e 72 h de incubação. Tendo em consideração os resultados previamente descritos, nomeadamente as características físico-químicas das NPs, a formulação PLGA-PEG_GCs foi selecionada para os restantes estudos. A estrutura dos péptidos foi mantida intacta, não sendo afetada pelo processo de dupla emulsão. A microscopia confocal confirmou a internalização das NPs, demonstrando a sua localização endosomal e uma tendência para se acumularem perto do retículo endoplasmático. Conclusões: Os resultados aqui descritos mostram que NPs estáveis e reprodutíveis foram produzidas utilizando um método de dupla emulsão com evaporação de solvente modificado. Importa no entanto realçar que as NPs PLGA- PEG_GCs constituem uma plataforma promissora para o transporte e eficaz apresentação de antigénios de HIV, tendo em vista o desenvolvimento de uma vacina eficaz contra a infeção por HIV-1.Purpose: Despite the improvements achieved in the current therapy regimens, the development of prophylactic, safe and highly immunogenic vaccines to control and eradicate the Human Immunodeficiency Virus (HIV) remains one of the most exigent and challenging tasks. To prevent HIV infection, highly specialized antigen presenting cells, as dendritic cells (DCs), have to elicit effective humoral and cellular immune responses. In fact, the induction of both virus-specific neutralizing antibodies (IgG and IgA), at the site of viral entry, and cytotoxic T lymphocyte along with a Th1 response seem to be crucial to impair the dissemination of the virus. As a promising strategy for HIV delivery systems, polymeric nanoparticles (NPs) can protect HIV-1 antigens from unfavorable conditions after administration, in addition to acting as adjuvants by enhancing the antigen uptake by DCs. T20 and T1249 antigenic peptides are HIV-1 fusion inhibitors derived from the gp41 helical region adjacent to the C-terminal sequence that have never been associated to a particulate delivery system. This project aims to design a HIV-1 vaccine throught the entrappement of HIV-1 antigenic peptides (T20 and T1249) into polymeric NPs. Materials and Methods: Polymeric NPs were prepared by the double emulsion solvent evaporation method and characterized. Polyvinyl alcohol, block co-polymer Pluronic® F127 and glycol chitosan were included in vaccine formulation to promote their potential adjuvant effect and/or improve NP stability. Model antigen ovalbumin and HIV-1 gp41 peptides, T20 and T1249, were entrapped or co-entrapped into NPs. Characterization of NPs was performed in terms of size, zeta potential and surface morphology by Dynamic Light Scattering, Laser Doppler Electrophoresis and Atomic Force Microscopy, respectively. Entrapment efficiency (EE, % (w/w)) and loading capacity (LC, μg/mg) of the entrapped agents were quantified by MicroBCA®, High Performance Liquid Chromatography and fluorescence. DCs were used to evaluate the in vitro cytotoxicity of NPs by the AlamarBlue® assay and the cellular uptake and intracellular trafficking of rhodamine-labeled NPs by confocal microscopy. The peptide integrity was also assessed by sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis. Results: NPs presented mean diameters in the range of 170-180 nm, with a narrow size distribution (PdI < 0.15), surface charge close to neutrality and spherical shape. These antigen delivery systems presented high EE and LC, and no cytotoxic effect on DCs, in the range of tested concentrations (0.125-1 mg/mL), after 24, 48 and 72 h of incubation. According to NP physicochemical characteristics, PLGA-PEG_GCs formulation was selected for further studies. Peptide structure was maintained intact, not being affected by the double emulsion procedure. Confocal microscopy confirmed the internalization of NPs, demonstrating their endosomal localization and a tendency to accumulate close to the endoplasmic reticulum. Conclusions: The results herein described show that stable and reproducible PLGA-PEG_GCs NPs produced using a modified double emulsion solvent evaporation method constitute a promising platform for the successful delivery of HIV antigens to DCs, in order to develop a HIV-1 vaccine